USO DE HERRAMIENTAS QUIMIOMETRICAS ASOCIADAS A TECNICAS ESPECTROSCOPICAS PARA SIMPLIFICAR LOS PROCESOS ANALITICOS EN EL CONTROL DE CALIDAD DE FARMACOS

Artículo completo
Introducción
El término quimiometría se emplea para describir el uso de métodos matemáticos, estadísticos y otros, basados en la aplicación de la lógica en el campo de la química, y en particular de la química analítica.¹ La complejidad de las matrices biológicas, de algunas muestras ambientales y de la mayoría de las preparaciones farmacéuticas (varios principios activos incorporados en una mezcla de varios excipientes), constituye un problema analítico frecuente. Esto hace que, en la actualidad, el uso de la cromatografía (en especial la cromatografía líquida de alta resolución o HPLC, del inglés high performance liquid chromatography), dada su gran selectividad, sea la técnica analítica utilizada en un alto porcentaje de los métodos analíticos recomendados por organismos oficiales.² Sin embargo, las técnicas cromatográficas presentan las desventajas de insumir un tiempo de análisis significativo, requerir costosos equipos y utilizar solventes, los que en algunos casos son sumamente contaminantes.
Por otra parte, una de las técnicas más adecuadas para el control de calidad de medicamentos y alimentos, monitoreo de fármacos en fluidos biológicos y análisis de contaminantes en muestras ambientales, por su sencillez, versatilidad y costo, es la espectrofotometría UV-Visible, tanto en mediciones de equilibrio como cinéticas. Esta técnica espectroscópica es muy utilizada para la determinación cualitativa y cuantitativa de medicamentos, ya sea como materias primas, en proceso de elaboración o como productos finales, ya se trate de monodrogas o de asociaciones farmacéuticas. Sin embargo, la determinación simultánea de varios componentes en la región ultravioleta resulta imposible, ya que la mayoría de los compuestos orgánicos absorben en esta zona del espectro, provocando intensos solapamientos espectrales. Con el fin de aumentar la selectividad de los procedimientos espectrofotométricos, puede hacerse uso de la reactividad química del analito, de manera que el producto de reacción absorba en otra región del espectro, eliminando así interferencias espectrales. Sin embargo, en muchas ocasiones, debido a la similitud estructural de los diferentes componentes de la muestra y a la falta de reactivos específicos, no se alcanza el nivel de selectividad deseado. Tal vez por ello las técnicas cromatográficas alcanzaron tan alto grado de popularidad en este campo, a pesar de las desventajas antes mencionadas.
La combinación de espectrofotometría UV-Visible y técnicas computacionales como las derivadas de los espectros o métodos de calibración multivariada constituyen una alternativa sencilla a los métodos cromatográficos en el control de calidad de medicamentos. Así, frente a la separación temporal conseguida en cromatografía, se propone el aislamiento matemático de las señales de los distintos componentes.
Entre los diferentes métodos quimiométricos aplicables a la resolución de señales instrumentales se encuentran los clásicos RCP (regresión en componentes principales) y RCMP (cuadrados mínimos parciales, o PLSR, del ingés partial least squares regression), cuya aplicación a problemas analíticos se está convirtiendo en una práctica rutinaria en laboratorios de control de calidad de fármacos y alimentos.^3-6 Todos los métodos se basan en la obtención de factores espectrales que permiten la construcción de modelos con alta capacidad de resolver mezclas de componentes presentando espectros muy solapados. Además de los métodos citados, capaces de resolver fundamentalmente problemas lineales, se está impulsando cada vez con mayor fuerza el uso de las redes neuronales artificiales (ANN, del inglés artificial neural networks).⁷ A las propiedades de cada uno en particular se suma la posibilidad de selección de sensores tanto en muestras de calibración como en muestras desconocidas, lo que produce un aumento de la selectividad de los métodos citados.⁶
El presente trabajo muestra el desarrollo de nuevas metodologías analíticas para el estudio de mezclas complejas de fármacos aplicando la espectroscopia de absorción electrónica acoplada a métodos quimiométricos. Se trata concretamente del análisis de los principios activos en dos presentaciones farmacéuticas: a) gotas nasales que contienen dexametasona (DEX), clorfeniramina (CLO) y nafazolina (NAF),⁸ y b) inyectables que contienen dipirona (DIP) y dextropropxifeno (DEP).⁹
Materiales
Instrumental
Las mediciones de absorción electrónica se realizaron con un espectrofotómetro Perkin-Elmer Lambda 20, usando cubetas de cuarzo de caras paralelas de 1.00 cm de lado. Los espectros fueron obtenidos y grabados en formato ASCII y luego transferidos a una computadora personal Pentium 550 para su posterior manipulación. Los cálculos se realizaron usando rutinas MATLAB 5.3¹⁰ escritas en nuestro laboratorio siguiendo algoritmos conocidos.^3,7 Para optimizar los modelos y seleccionar las longitudes de onda de trabajo se aplicó una estrategia de movimiento de ventana-mínimo PRESS implementada con el programa MVC1.^11,12
Las mediciones cromatográficas se realizaron en un cromatógrafo Shimadzu, equipado con lo siguiente: dos bombas, detector UV (215 nm) e inyector manual (20 μl). Se utilizó una columna LiChrospher® 100, C18, 5 μm, 250 x 4 mm I.D., Merck. Se trabajó a una temperatura de 35ºC.
Reactivos
Todos los experimentos se realizaron usando reactivos calidad analítica y calidad HPLC. Se prepararon soluciones patrones 500 mg/l de todos los fármacos utilizados disolviendo las cantidades adecuadas de droga pura en agua doble destilada. También se preparó una solución de HCl 0.01 mol/l para ajustar a pH = 2.
Juegos de muestras de calibración y validación
Los métodos de calibración multivariada requieren la preparación de juegos de calibración y validación siguiendo diseños estadísticos. Para estos trabajos se prepararon los juegos siguiendo diseños centrales compuestos, para dos y tres componentes según el sistema estudiado. En los casos de dos componentes se prepararon juegos de 12 mezclas. En los de tres componentes se prepararon juegos de 15 mezclas. La tabla 1 muestra el diseño de calibración para el caso de la determinación de clorfeniramina, nafazolina y dexametasona.

Muestras
Se analizaron muestras comerciales que contenían los citados principios activos. Estas fueron: a) gotas nasales conteniendo, cada 100 ml: 100 mg de maleato de clorfeniramina, 100 mg de nafazolina y 5 mg de fosfato disódico de dexametasona, y b) inyectables conteniendo, cada 5 ml: clorhidrato de dextropropoxifeno, 50 mg y dipirona, 1 500 mg. Antes de hacer las mediciones se realizaron las siguientes diluciones: las gotas, 3/25 en agua destilada, y los inyectables, 1/2 500 en ácido clorhídrico 0.01 mol/l. Las concentraciones finales fueron: CLO, 100 mg/l, NAF, 100 mg/l y DEX, 5 mg/l (estos tres en gotas) y DEP, 4 mg/l y DIP, 120 mg/l (en inyecciones).
Resultados y discusión
La figura 1 (A) muestra los espectros de absorción electrónica de soluciones acuosas conteniendo 10 mg/lcada una de DEP y DIP. En dicha figura puede observarse que existe un solapamiento espectral que impide la cuantificación directa de los compuestos. Sin embargo, las muestras reales presentan un problema adicional: la gran desproporción de las cantidades presentes de ambos principios activos. Si se observa la figura 1 (B), que corresponde a ambos analitos, realizada en las concentraciones obtenidas al diluir una muestra del inyectable 2 500 veces, se nota que para obtener un espectro del compuesto DEP que presente una señal diferente de la del ruido instrumental se hace necesario incrementar la concentración del otro compuesto (DIP) para mantener la relación existente en el preparado farmacéutico. Esta alta concentración produce señales con valores de absorbancia entre 2 y 3 unidades, originando pérdida de linealidad por incumplimiento de la ley de Lambert-Beer de la espectroscopia.¹³

Figura 1. (A) Espectros de dipirona (DIP) y dextropropoxifeno (DEP) en agua y a una concentración de 10 mg/l cada uno. 1 (B) Los mismos compuestos de la figura 1(A) pero a la concentración correspondiente a la dilución 1/2 500 del inyectable, es decir DEP, 4 mg/l y DIP, 120 mg/l.

Por las razones previamente citadas, se planteó la hipótesis de trabajo de que la presencia de estas no linealidades sería un obstáculo difícil de resolver aplicando métodos multivariados de rutina del tipo PLSR, y que podría obtenerse una sustancial mejora de los resultados por aplicación de métodos más robustos como son las redes neuronales artificiales. Estas no trabajan ajustando un modelo explícito, sino que lo hacen a través de unidades de activación llamadas neuronas. La figura 2 muestra un esquema de la red utilizada en la que pueden verse neuronas de entrada, ocultas y una de salida. Las neuronas de entrada corresponden a componentes principales de los espectros de las mezclas de calibración, validación o de muestras incógnitas. Las neuronas de la capa oculta y de salida tienen pesos y funciones de transferencia que relacionan la señal de salida con un dato conocido en una etapa llamada de "entrenamiento". En esta etapa se busca que la red relacione las señales de entrada con los valores de concentración de las mezclas contenidas en el juego de calibración. Así, por medio de un proceso iterativo llamado de retroalimentación del error, se busca minimizar el error y conseguir que la red "aprenda" a reconocer la concentración del analito de interés en las futuras muestras desconocidas. La optimización de la red es un tedioso procedimiento que consiste en seleccionar el número óptimo de neuronas y los valores de los pesos que son aplicados a la entrada de las mismas para conseguir el mínimo de error.

Figura 2. Esquema de una red neuronal (ANN) que muestra las capas de entrada (señales xi), escondida y de salida. Los pesos (wi) actúan en el contacto de las neuronas y la suma de los pesos es luego pasada a través de una función de transferencia. La señal de salida es utilizada para calcular el error y realizar una corrección a través del procedimiento de retroalimentación del error.

La tabla 2 muestra los resultados obtenidos por aplicación de PLSR y ANN a las muestras de validación de los modelos y también a las muestras comerciales para ambos sistemas estudiados. Como puede apreciarse, se tiene una mejora sustancial en la predicción de las concentraciones, en especial para aquellos analitos que presentan pérdida de linealidad en el sistema de medición. Para los analitos que presentan una relación lineal entre la señal y la concentración, los resultados obtenidos por aplicación de redes son similares a los obtenidos por aplicación de PLSR. Por ello la estrategia propone la utilización de ambos métodos para lograr el objetivo de la cuantificación de los analitos presentes en la mezcla: PLSR, más simple y rápido para los analitos lineales, y ANN, más complicado y lento para los analitos con comportamiento no lineal, pero cuyo análisis resulta imposible por aplicación de los modelos lineales del tipo de PLSR o RCP.

Conclusiones
La implementación de control de calidad en fármacos es una necesidad para asegurar la calidad de los medicamentos usados por la población. En algunos casos se hace necesario el desarrollo de nuevos métodos de análisis que hagan factible el análisis de dichos medicamentos, debido a que no se tienen monografías en las farmacopeas o los laboratorios no cuentan con el instrumental requerido por éstas. Otras veces se busca que los métodos sean rápidos, simples y no contaminantes. El uso de herramientas quimiométricas combinadas con espectroscopias simples, como la espectroscopia UV, permite el desarrollo de métodos confiables que posibilitan realizar estos controles. Sólo hacen falta un espectrofotómetro capaz de generar datos en formato de texto y los programas de computación adecuados. Estos últimos se pueden comprar o en algunos casos obtener de Internet.^12,14
El autor no manifiesta conflictos.

Bibliografía del artículo

Brereton R, Chemometrics. Aplications of mathematics and statistics to laboratory systems. Ellis Horwood, New York, 1-26, 1999.
USPXXIV, United States Pharmacopeia XXIV, USP Convention, Rockville, MD, 2000.
Thomas EV, Haaland DM. Partial least-squares methods for spectral analyses. 1. Relation to other quantitative calibration methods and the extraction of qualitative information. Anal. Chem. 1988, 60:1193-1202.
Martens H, Naes T. Multivariate Calibration, Wiley, Chichester, 1989.
Blanco M, Coello J, Iturriaga H, Maspoch S, De la Pezuela C. Quantitation of the active compound and major excipients in a pharmaceutical formulation by near infrared diffuse reflectance spectroscopy with fibre optical probe. Anal. Chim. Acta 1996, 333:147-156.
Muñoz de la Peña A, Espinosa Mansilla A, Acedo Valenzuela M, Olivieri AC, Goicoechea HC. Comparative study of net analyte signal-based methods and partial least squares for the simultaneous determination of amoxycillin and clavulanic acid by stopped-flow kinetic analysis. Anal. Chim. Acta, 2002, 463:75-88.
Zupan J, Gasteiger J. Neural Networks in Chemistry and Drug Design, Wiley-VCH, 2nd edition, Weinheim, 1999.
Collado MS, Satuf ML, Goicoechea HC, Olivieri, AC. Complementary use of partial least-squares and artificial neural networks for the non-linear spectrophotometric analysis of pharmaceutical samples. Anal. Bioanal. Chem. 2002, 374:460-465.
Cámara MS, Ferroni FM, De Zan M, Goicoechea HC. Sustained modelling ability of artificial neural networks in the analysis of two pharmaceutical (dextropropoxyphene and dipyrone) present in unequal concentrations. Anal. Bioanal. Chem., 2003, 376:838-843.
MATLAB 5.3, The MathWorks Inc., Natick, Massachusetts, USA, 1999.
Collado MS, Mantovani VE, Goicoechea HC, Olivieri AC. Simultaneous spectrophotometric-multivariate calibration determination of several components of ophthalmic solutions: phenylephrine, chloramphenicol, antipyrine, methylparaben and thimerosal. Talanta 2000, 52:909-920.
Olivieri AC, Goicoechea HC, Iñón F. MVC1: An integrated MATLAB toolbox for first-order multivariate calibration. Chemom. Intell. Lab. Syst., en prensa.
Skoog DA, Holler FJ, Nieman TA. Principios de análisis instrumental. Mc Graw Hill, Quinta Edición, Madrid, 2001.
Goicoechea HC, Olivieri AC. MULTIVAR: a program for multivariate calibration incorporating net analyte signal calculations. Trends Anal. Chem. (TRAC), 2000, 19:599-605.