DETECÇÃO DE ANTICORPOS SÉRICOS ANTI-<I>GIARDIA LAMBLIA </I>EM CRIANÇAS ATENDIDAS EM CRECHES

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Introdução
Atualmente, a infecção causada pelo protozoário intestinal Giardia lamblia (sin. Giardia duodenalis, Giardia intestinalis) é considerada uma das principais causas de diarréia em todo o mundo, principalmente, nos países em desenvolvimento, onde a incidência da giardíase é, geralmente, quatro vezes maior do que nos países desenvolvidos. As altas taxas de giardíase são creditadas às condições e aos precários padrões de higiene prevalentes nessas regiões.
A infecção por G. lamblia apresenta distribuição cosmopolita, sendo que, em média 10% a 15% da população do mundo está infectada. As maiores prevalências, variando entre 20% e 60%, têm sido observadas entre crianças, principalmente aquelas mantidas em instituições como as creches.^1-4 Nesses locais, as crianças são expostas a infecções em uma idade em que ainda não adquiriram hábitos de higiene pessoal, podendo transmitir o parasita aos seus familiares, às outras crianças ou às pessoas que trabalham nesses estabelecimentos, além de contaminarem o ambiente.⁵
A infecção por Giardia apresenta um espectro clínico diverso, variando desde indivíduos assintomáticos até pacientes sintomáticos com quadro de diarréia aguda ou crônica. Na maioria dos casos, a infecção é resolvida espontaneamente e os sintomas desaparecem após algumas semanas. Nas infecções sintomáticas, os pacientes apresentam perda de apetite, esteatorréia e emagrecimento; na diarréia crônica as principais complicações estão associadas à má absorção de gordura e nutrientes como vitaminas lipossolúveis, ferro, xilose e lactose. Em crianças, estas deficiências nutricionais podem ter efeitos mais severos, causando retardo no desenvolvimento e no crescimento.⁶Na rotina, o diagnóstico da infecção por Giardia é feito a partir do exame microscópico de uma única amostra de fezes para a pesquisa de cistos e/ou trofozoítos, entretanto, essa conduta favorece à ocorrência de falso-negativos, uma vez que, a eliminação de cistos nas fezes é intermitente. Desta forma, o exame de pelo menos três amostras de fezes, em dias não consecutivos, faz-se necessário para o diagnóstico, uma vez que o exame de uma única amostra identifica apenas 50% a 70% dos casos positivos.⁷ Outro aspecto a ser considerado, é o fato de que, o padrão de excreção de cistos pode variar de indivíduo para indivíduo, principalmente, em crianças de baixa idade, sendo que nos baixos excretores as amostras de fezes podem permanecer negativas por 20 dias consecutivos.¹ Em alguns pacientes com diarréia crônica, o exame de várias amostras de fezes mantêm-se negativo, apesar da presença de trofozoítos no duodeno. Nesses casos, o exame microscópico do aspirado e de biópsias duodenais tem sido auxiliar no diagnóstico da infecção, contudo, considerando que são processos desconfortáveis e invasivos, evita-se empregá-los quando os pacientes são crianças.
Há alguns anos, com o propósito de melhorar e ampliar as alternativas para o diagnóstico da infecção por Giardia, principalmente, em crianças, vários métodos imunológicos têm sido desenvolvidos para a detecção de anticorpos e antígenos específicos. Anticorpos séricos anti-Giardia têm sido identificados em indivíduos de diferentes regiões do mundo, tanto em pacientes com infecção assintomática quanto sintomática.^3,8,9 Muitos desses estudos têm proposto a detecção de IgG anti-Giardia em indivíduos sintomáticos, entretanto, em áreas endêmicas, a maioria dos casos é assintomática.
Diante dessas considerações, realizamos um estudo com o objetivo de detectar anticorpos séricos anti-Giardia em crianças atendidas em creches, e estimar a freqüência de infecção por Giardia em área endêmica. Além disso, foi verificada a possibilidade do emprego de métodos sorológicos para determinar a freqüência da infecção em grupos da população, onde predominam casos assintomáticos. É importante ressaltar que, nos ensaios imunológicos foram utilizados antígenos preparados a partir de trofozoítos de Giardia de cepa autóctone, isolada e axenizada no Brasil, e amostras de sangue coletadas em papel de filtro.
Material e métodos
Particiapram do estudo em questão, 147 crianças atendidas em três creches da rede municipal de Botucatu, Estado de São Paulo, Brasil, com idade variando de 0 a 6 anos (estudo aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina da Universidade Estadual Paulista e pela Secretaria Municipal de Educaçao). Três amostras de fezes de cada criança, coletadas com intervalo de sete dias, foram processadas pelos métodos de sedimentação espontânea¹⁰e flutuação pelo sulfato de zinco.¹¹
Amostras de sangue obtidas da polpa digital foram coletadas em papel de filtro e armazenadas a -20ºC, até o momento do uso. Para a obtenção dos eluatos a uma diluição de 1:20, discos (1.32 cm²) de papel de filtro contendo amostras de sangue foram incubados em 0.4 ml de PBS (pH 7.2) durante 30 min.
Para a detecção de anticorpos IgG anti-Giardia, todos os eluatos foram testados em reação de imunofluorescência indireta (RIFI)¹² e ELISA.¹³ Nesses ensaios, foram empregados como antígenos, trofozoítos de Giardia da cepa BTU-1, isolada e axenizada no Brasil, a partir de cistos de indivíduo assintomático. Eluatos obtidos de recém-nascidos foram empregados como controles negativos. A fim de se verificar a ocorrência de reações cruzadas, eluatos obtidos de casos positivos para Giardia foram absorvidos com antígenos de Giardia, Ascaris lumbricoides e Hymenolepis nana. Controles positivos e negativos e eluatos absorvidos foram incluídos em todos os ensaios. Na RIFI, os eluatos foram considerados negativos quando o título foi menor do que 1:40. Nas reações de ELISA, os eluatos apresentando leituras de densidade óptica (DO) abaixo da média dos controles negativos a 1:40 acrescida de dois desvios padrões (X ± 2 s) foram considerados negativos.
Os dados foram analisados considerando-se a concordância entre os resultados obtidos nas reações de IFI e de ELISA e o exame parasitológico de três amostras de fezes. A concordância entre cada método sorológico e o exame de fezes foi determinada considerando-se os casos positivos e negativos detectados em cada método. A sensibilidade e a especificidade dos métodos imunológicos foram determinadas a partir da interpretação visual das lâminas de IFI e leitura dos valores de densidade óptica em ELISA.
Resultados
De um total de 147 crianças, 93 (63.3%) apresentaram cistos de Giardia nas fezes, sendo que, trofozoítos não foram detectados em nenhuma das amostras examinadas. As maiores porcentagens de infecção foram observadas entre crianças com idade variando de 12 a 47 meses, principalmente, no grupo de 36 a 47 meses (18.3%). Além de infecção por Giardia, outros parasitas intestinais foram diagnosticados: Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Enterobius vermicularis, Ancylostomatidae, Strongyloides stercoralis, Hymenolepis nana, Entamoeba coli e Blastocystis hominis. Entre as 93 amostras de fezes com cistos de Giardia e as 54 amostras negativas, em 40 (43%) e em 20 (37%) amostras, respectivamente, foram detectados outros parasites intestinais.
Dos 147 eluatos testados, 93 (63.3%) e 100 (68%) foram positivos para Giardia nas reações de IFI e de ELISA, respectivamente (tabela 1). Na reação de imunofluorescência indireta, dos 93 eluatos obtidos de crianças com cistos nas fezes e dos 54 eluatos obtidos entre os casos negativos, anticorpos foram detectados em 76 (81.7%) e 17 (31.5%), respectivamente (tabela 1). Em relação ao método de ELISA, testando-se os mesmos eluatos, anticorpos foram detectados em 67 (72%) e 33 (61%), respectivamente (tabela 1). Sendo assim a reação de IFI apresentou sensibilidade de 82% e especificidade de 70%, enquanto que no método de ELISA os valores foram de 72% e 39%, respectivamente. A concordância entre os resultados obtidos nas reações de IFI e de ELISA e o exame parasitológico de três amostras de fezes foi de 76.9% e 59.9%, respectivamente (tabela 1).

Nas reações de IFI, os eluatos testados apresentaram títulos baixos variando de 1:40 a 1:80. De 93 eluatos positivos em IFI, 54 (58.1%) foram positivos a 1:40. A análise da proporção dos títulos observados na reação de IFI em relação aos resultados do exame de fezes revelou que a maior parte dos eluatos obtidos de crianças infectadas e soropositivas apresentou título maior do que 1:40, enquanto que os eluatos obtidos dos indivíduos não infectados apresentaram títulos inferiores a 1:40.
Em relação ao método de ELISA, os títulos também foram baixos e variaram de 1:40 a 1:640. Muitos dos eluatos obtidos de crianças parasitadas apresentaram títulos muito próximos, observando-se sobreposição desses valores com aqueles demonstrados nas reações com eluatos de indivíduos com exame de fezes negativo. Entretanto, os títulos mais altos foram observados entre os eluatos obtidos de crianças com cistos nas fezes. A análise da proporção dos títulos verificados em ELISA, demonstrou que não houve diferença significativa entre os títulos < 1:40, 1:40, 1:80 e 1:160. Nos casos negativos, também observou-se diferença entre os títulos < 1:40 e 1:40. Nos testes de absorção, somente os eluatos pré-absorvidos com antígeno de Giardia demonstraram redução significativa dos títulos, não se observando qualquer variação quando os mesmos eluatos foram absorvidos com antígenos de Ascaris lumbricoides e Hymenolepis nana.
Discussão
No Brasil, a prevalência da infecção por Giardia varia de 4% a 30%, sendo que prevalências altas variando de 20% a 60% são comumente observadas em crianças, principalmente, quando mantidas em creches. Considerando que no Brasil, a infecção por Giardia é endêmica em muitas regiões, ainda são escassos estudos soroepidemiológicos realizados entre crianças.
Vários métodos sorológicos têm sido avaliados para o diagnóstico da infecção por Giardia, principalmente, em indivíduos sintomáticos, nos quais a produção de anticorpos anti-Giardia é maior do que nos indivíduos assintomáticos.
Considerando que, nas áreas endêmicas, a maioria das infecções é assintomática, o presente estudo foi realizado com amostras provenientes de crianças assintomáticas atendidas em creches. A freqüência da infecção por G. lamblia foi estimada comparando-se os níveis de anticorpos IgG anti-Giardia detectados pelos métodos de IFI e de ELISA à freqüência de infecção por Giardia determinada pelo exame parasitológico de três amostras de fezes. Na tentativa de incrementar a sensibilidade e a especificidade dos ensaios imunológicos, os antígenos foram preparados a partir de trofozoítos de Giardia de cepa autóctone, isolada e axenizada no Brasil. Isto porquê, isolados de Giardia de uma determinada região geográfica pode apresentar determinantes antigênicos que não são reconhecidos pelos anticorpos produzidos por indivíduoas infectados com isolados de outras regiões.
Outro diferencial quanto à metodologia, foi o emprego de amostras de sangue obtidas da polpa digital e coletadas em papel de filtro. Geralmente, tem-se empregado como fonte de anticorpos, amostras de sangue obtidas por punção venosa. Entretanto, em se tratando de um levantamento epidemiológico realizado entre crianças com idade variando de 0 a 6 anos, foi necessário adotar uma conduta que facilitasse a obtenção do material, sem contudo, ser agressiva e invasiva. Atendendo esses requisitos, a coleta de sangue em papel de filtro é relativamente indolor e não invasiva, além do que, as amostras não necessitam ser centrifugadas, separadas e, imediatamente, congeladas.
Em relação aos métodos sorológicos empregados no presente estudo, os resultados obtidos com a reação de IFI apresentaram maior concordância com os resultados do exame de três amostras de fezes, além do que, essa reação sorológica foi mais sensível e apresentou maior especificidade do que o método imunoenzimático - ELISA.
Resultados semelhantes foram demonstrados por outros autores,¹⁴ que empregando as mesmas técnicas para a detecção de anticorpos anti-Giardia em indivíduos sintomáticos e assintomáticos, observaram que RIFI e ELISA foram igualmente sensíveis, porém o método de ELISA mostrou-se menos específico. Concordando com trabalhos anteriores realizados em áreas endêmicas,^15,16 no presente estudo, não foi possível estabelecer uma correlação entre a infecção e a presença de anticorpos circulantes. Além disso, nos ensaios com ambos os métodos sorológicos observou-se sobreposição dos títulos dos eluatos obtidos de crianças com cistos nas fezes e daqueles obtidos dos indivíduos não parasitados.
De acordo com as nossas observações, os resultados obtidos nas reações de IFI e de ELISA não apresentaram concordância satisfatória com os resultados do exame parasitológico de três amostras de fezes. Entretanto, vale ressaltar que com ambos os métodos, as taxas de soropositividade foram altas, a saber, 63% e 68%, para RIFI e ELISA, respectivamente. Esses valores foram semelhantes à taxa de infecção obtida a partir do exame parasitológico de três amostras de fezes por indivíduo.
A baixa concordância entre os resultados do exame de fezes e dos títulos de anticorpos foi relatada previamente em estudo realizado em Bangladesh, área considerada de alta endemicidade para Giardia.¹⁶ Em áreas de alta endemicidade, a exposição contínua e o alto nível de infecção durante os primeiros anos de vida, são consideradas causas que justificam a persistência dos anticorpos circulantes e, conseqüentemente, tais discrepâncias entre os resultados da sorologia e do exame parasitológico de fezes.¹⁷
Nos vários estudos em que os métodos sorológicos foram empregados para o diagnóstico de giardíase, encontram-se desde resultados em que estes testes foram capazes de discriminar as infecções e até os que a ocorrência de sobreposição dos títulos dificulta tal discriminação. Sendo assim, é importante ressaltar que nem todo o resultado discrepante deve ser rejeitado, sem que antes sejam considerados alguns aspectos: (1) o emprego de diferentes cepas de Giardia para a obtenção dos antígenos, uma vez que, diferenças antigênicas entre os isolados podem interferir na produção de anticorpos;¹⁸ (2) a maioria dos estudos realiza a pesquisa de anticorpos, principalmente, em indivíduos com infecção sintomática e em áreas onde a giardíase não é endêmica; (3) nas infecções assintomáticas, o tipo de resposta imune desenvolvida ainda é pouco conhecido;¹⁸ (4) como os trofozoítos, raramente, invadem os tecidos, a resposta por anticorpos sistêmicos é mais discreta e na maioria das infecções, os títulos de anticorpos são baixos; (5) a avaliação de diferentes técnicas sorológicas e variação das condições para execução dos métodos.
Considerando as informações reunidas até o momento, tem-se questionado o emprego da pesquisa de anticorpos séricos como marcador para a infecção por Giardia em indivíduos residentes em áreas onde as taxas de infecção são muito altas. Por outro lado, não descarta-se a possibilidade de que, nessas áreas, a detecção de anticorpos séricos possa ser uma ferramenta complementar nos estudos epidemiológicos que visam estimar a freqüência da infecção. Entretanto, cabe destacar que, em áreas endêmicas de poucos recursos, a despeito das limitações, o exame parasitológico de fezes ainda é a alternativa mais viável para se verificar a ocorrência de infecção por Giardia, tanto no diagnóstico individual quanto em levantamentos epidemiológicos.
Los autores no manifiestan conflictos.