ALTERACIONES INDUCIDAS POR EL AGENTE ANTITUMORAL HEXADECILFOSFOCOLINA SOBRE EL METABOLISMO LIPIDICO EN CELULAS HEPG2

Conclusión breve
Hemos demostrado que la HePC interfiere con la síntesis de fosfatidilcolina vía CDP-colina y vía metilación de fosfatidiletanolamina en células de hepatoma humano HepG2, utilizadas habitualmente como modelo en estudios de metabolismo lipidico hepático

Resumen

Las alquilfosfocolinas, compuestos derivados de los fosfolípidos naturales, son un nuevo grupo de agentes antiproliferativos que ejercen sus efectos citostáticos al interactuar con lípidos y procesos dependientes de membrana. Uno de los compuestos antiproliferativos representativos de estos análogos lipídicos es la hexadecilfosfocolina (HePC), agente que ejerce actividad hacia diversos tumores y líneas celulares tumorales. Actualmente es utilizada para el tratamiento tópico paliativo de metástasis cutáneas derivadas de carcinomas mamarios. En nuestro laboratorio hemos demostrado recientemente que la HePC interfiere con la síntesis de fosfatidilcolina vía CDP-colina y vía metilación de fosfatidiletanolamina en células de hepatoma humano HepG2, utilizadas habitualmente como modelo en estudios de metabolismo lipidico hepático. Es interesante destacar que la HePC interfiere también en el metabolismo de esfingolípidos, reduciendo la formación de esfingomielinas y provocando simultáneamente un incremento en la producción de ceramidas. Todas estas alteraciones metabólicas podrían estar asociadas con cambios morfológicos en la célula que apuntan hacia un proceso apoptótico inducido por este agente. Ello confirma el potencial de la HePC como agente antineoplásico.

Palabras clave
Hexadecilfosfocolina, biosíntesis de fosfatidilcolina, CTP:colina-fosfato citidililtransferasa, apoptosis y células HepG2

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Especialidades

Principal: Bioquímica, Oncología,

Relacionadas: Medicina Interna,

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María P. Carrasco Jiménez. Avda. Fuentenueva s/n 18071 Granada (España). Carrasco Jiménez, María Paz

INFLUENCE OF THE ANTITUMORAL HEXADECYLPHOSPHOCHOLINE UPON GLYCEROLIPID METABOLISM IN HepG2 CELLS

Abstract
Alkylphosphocholines, derived from naturally occurring phospholipids, are a new class of antineoplastic agents which exerts their cytostatic effect by interacting with lipid membranes and membrane-dependent processes. One of the most characterized compounds in this group is hexadecylphosphocholine (HePC), which exerts antitumoral activity against a broad spectrum of established tumour cell lines. It is currently used for the topical palliative treatment of cutaneous metastases of mammary carcinomas. In our laboratory, we have recently reported that HePC interferes with phosphatidylcholine synthesis via both CDP-choline and phosphatidylethanolamine methylation in HepG2 human hepatoma cell line, frequently used as a model for studies of hepatic lipid metabolism. Interestingly, HePC also interferes with sphingolipid metabolism by reducing the formation of sphingomyelin. This reduction is accompanied by a substantial increase in the production of ceramides. All these metabolic alterations could be associated with morphological changes in the cell, which can induce the apoptotic process. These results confirm the potential of HePC as antineoplastic agent.

Key words
Hexadecylphosphocholine, phosphatidylcholine synthesis, apoptotic, HepG2 cells

ALTERACIONES INDUCIDAS POR EL AGENTE ANTITUMORAL HEXADECILFOSFOCOLINA SOBRE EL METABOLISMO LIPIDICO EN CELULAS HEPG2

(especial para SIIC © Derechos reservados)

Artículo completo
Algunos compuestos análogos de los fosfolípidos naturales muestran citotoxicidad selectiva hacia diversos tipos de células tumorales. Esta especificidad en la acción antitumoral permite un uso terapéutico dirigido contra determinados tumores. Existe considerable interés en examinar la actividad biológica de estos compuestos, que inhiben el crecimiento de células transformadas sin interactuar con el ADN,¹ por lo que su aplicación puede complementar las quimioterapias antineoplásicas.
Las alquilfosfocolinas (APC) son un nuevo grupo de agentes antiproliferativos sintéticos y metabólicamente estables, candidatos prometedores de una nueva aproximación a la quimioterapia contra el cáncer.² La hexadecilfosfocolina (HePC) es el principal representante de las APC. Este compuesto presenta actividad citostática hacia diversos tumores y líneas celulares. Actualmente es empleado como fármaco (Miltex®) para el tratamiento tópico paliativo de metástasis cutáneas derivadas de carcinomas mamarios.^3,4 Recientemente, además, algunos estudios preclínicos demostraron su utilidad para el tratamiento de ciertos linfomas cutáneos. Aparte de su eficacia antitumoral, la HePC ejerce destacable actividad contra enfermedades infecciosas parasitarias causadas por Tripanosoma o Leishmania.^5,6
Debido a su carácter anfifílico, las APC pueden acceder prácticamente a todos los tejidos del organismo e incorporarse a la bicapa lipídica, interactuando con diversos componentes lipídicos y proteicos de las membranas biológicas,⁷ pudiendo modular sus propiedades fisicoquímicas y, por tanto, los procesos celulares asociados a membrana, como las rutas de transducción de señales y metabolismo lipídico.^1,8,9 Además, estos agentes sintéticos presentan múltiples características de interés biológico, con alto valor potencial para la terapia antitumoral, ya que son capaces de inducir respuestas de diferenciación y apoptosis en células malignas,^10,11 inhibir la invasión tumoral e incluso modular la respuesta inmune.⁹
Sin embargo, a pesar del conocimiento de algunos de los efectos biológicos provocados por estos compuestos, aún no se ha establecido el mecanismo molecular preciso responsable de la mayoría de las acciones que determinan el alto grado de selectividad antitumoral. Existen distintas líneas de investigación que sugieren la posible interferencia de las APC con una etapa inicial en los procesos de transducción de señales en células hiperproliferativas, la cual puede ser reponsable de su capacidad para inhibir el crecimiento celular.^8,12 Varios autores han descrito que la HePC podría actuar sobre el metabolismo de fosfolípidos a nivel de actividades fosfolipasas u otros procesos metabólicos,^13-15 aunque en cualquier caso la influencia de estos agentes puede ser multifactorial y ser el resultado de acciones combinadas sobre distintos sitios celulares.
Así pues, se ha propuesto una amplia variedad de posibles mecanismos de acción para HePC, en distintas líneas celulares, aunque no existen datos acerca de su influencia y efectos sobre líneas celulares de procedencia hepática. Por ello, en nuestro estudio analizamos las alteraciones ocasionadas por la HePC a nivel del metabolismo lipídico en células de hepatoma humano HepG2, con la intención de elucidar los mecanismos bioquímicos por los cuales este agente ejerce su actividad en estas células tumorales.
En primer lugar, evaluamos la actividad citotóxica y antiproliferativa de la HePC, en función de la dosis y el tiempo de exposición, en células HepG2. Nuestros datos indican que concentraciones superiores a 100 μM durante 6 horas producen alteraciones de permeabilidad de la membrana plasmática y, en consecuencia, causan un efecto lítico, rápido e inespecífico (figura 1a). No obstante, la exposición de las células a concentraciones de HePC 50-75 μM produce una reducción en el número de células viables sin indicios aparentes de toxicidad (figura 1b). Este resultado indica que el efecto citostático ejercido por la HePC es específico, aboliendo la proliferación celular cuando aún las células son viables.

Figura 1. Efecto citotóxico y antiproliferativo de HePC en células HepG2. Las células en fase logarítmica fueron incubadas durante 6 h con diferentes concentraciones de HePC. La producción de formazán a partir de MTT se determina como absorbancia medida a 570 nm con sustracción del fondo a 630 nm por min y millón de células (a). A los tiempos seleccionados, realizamos un recuento celular con un hemocitómetro (b). Los resultados son media de tres determinaciones en respuesta a cada dosis.

Para determinar la posible interferencia de este compuesto en el metabolismo de acilgliceroles se incubaron las células en presencia de HePC y glicerol marcado radiactivamente como sustrato lipogénico. La utilización de glicerol permitió analizar simultáneamente la influencia de la HePC sobre la biosíntesis de fosfolípidos y lípidos neutros, comprobando que la APC estimula la incorporación de este precursor lipogénico a diacilglicerol (DAG). El DAG es un intermediario clave en la síntesis de glicerolípidos, de modo que cabría esperar que un incremento en su síntesis produjera mayor síntesis de los lípidos de los que es precursor: triacilglicerol (TAG), fosfatidiletanolamina (PE) y fosfatidilcolina (PC). Sin embargo, los resultados obtenidos en nuestro laboratorio muestran que las células expuestas a la alquilfosfocolina presentan reducción notable de la biosíntesis de novo del fosfolípido mayoritario PC, mientras que, simultáneamente, se produce una activación en la síntesis de TAG. El análisis detallado de la ruta de biosíntesis de PC vía CDP-colina mediante el estudio de las enzimas implicadas en la biosíntesis de este fosfolípido reveló que la actividad citosólica colina quinasa (CK) y la actividad ligada a membrana diacilglicerol colinafosfotransferasa (CPT) permanecen inalteradas por la HePC, mientras que la actividad CTP:colina-fosfato citidililtransferasa (CT) fue sensiblemente modificada. Esta enzima cataliza la etapa limitante en la biosíntesis de PC en eucariotas superiores. Uno de los mecanismos de regulación de su actividad es el control de la traslocación de la enzima entre citosol y membranas. El proceso de traslocación es regulado por diversos lípidos y se acepta que la forma soluble de la CT, libre de lípidos, es inactiva, mientras que la ligada a membrana es activa. Después de exponer las células HepG2 a HePC durante 6 h, la actividad CT disminuye significativamente en la fracción particulada de las células e incrementa en la fracción soluble. Por tanto, nuestros resultados demuestran que la HePC afecta la distribución subcelular de la CT, interfiriendo con la traslocación de la forma soluble inactiva de la enzima a la membrana, reduciendo drásticamente la formación de PC.
Se ha descrito que en condiciones de déficit de síntesis de PC, vía CDP-colina, las células pueden responder incrementando la producción de este fosfolípido por la vía alternativa de metilación microsomal de PE. Ello constituye un mecanismo de compensación homeostático que permite mantener constantes los niveles intracelulares de PC. Cuando analizamos la síntesis de PC a partir de etanolamina, comprobamos que la exposición de las células a HePC produce un claro descenso de la radiactividad en los intermediarios metabólicos así como en el producto final, PC, de esta vía de metilación, como consecuencia de una inhibición de la actividad fosfatidiletanolamina N-metiltransferasa (PEMT). Estos resultados constituyen la primera demostración experimental de la acción de la HePC sobre el metabolismo de PC tanto a través de la vía CDP-colina como a nivel de la ruta de metilación.
Especial interés presenta la posible repercusión que las alteraciones en la biosíntesis de PC pueden tener en la formación intracelular de esfingomielina (SM), puesto que la PC es precursora, junto con las ceramidas, de estos esfingolípidos. De hecho, recientemente, mediante el empleo de precursores marcados isotópicamente, demostramos que la APC produce un fuerte descenso en la formación de SM, efecto que va acompañado de una acumulación de ceramidas.
Todos los resultados expuestos sugieren que la HePC puede interferir con rutas de transducción intracelular de señales que están implicadas en procesos tales como proliferación, diferenciación y muerte celular. Así, se indicó que la inducción de apoptosis puede depender de la relación entre las concentraciones celulares de ceramidas y DAG. Puesto que la APC provoca un aumento en la producción de ambos lípidos, es posible que este efecto sea el responsable, en parte, de las acciones producidas por HePC a nivel de proliferación y viabilidad celular.
En este sentido comprobamos, además, que las alteraciones metabólicas observadas se encuentran asociadas con un cambio en la morfología celular, evidente por microscopia óptica. Así, las micrografías de células HepG2 sometidas a tratamiento con HePC muestran alteraciones del aspecto celular, apreciándose cómo la célula adquiere forma redondeada, con una drástica reducción del volumen celular y pérdida de su capacidad de adherencia y morfología epitelial, lo que sugiere la posible inducción de un proceso apoptótico por este agente.
En conclusión, nuestro estudio, realizado en la línea celular de hepatoma HepG2, muestra que la HePC interfiere de modo específico en el metabolismo de fosfolípidos que contienen colina. Los cambios metabólicos producidos por esta APC parecen estar asociados con alteraciones morfológicas que apuntan hacia un proceso apoptótico inducido por este agente. Esto confirma el potencial de la HePC como agente antineoplásico.
Los autores no manifiestan conflictos.

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