MODELO MOLECULAR UNIFICADO DE ESTRES OXIDATIVO EN LAS ENFERMEDADES DE ALZHEIMER Y PARKINSON

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La enfermedad de Alzheimer (EA) y la enfermedad de Parkinson (EP) son dos entidades neurodegenerativas progresivas que afectan a millones de personas en el mundo y ocupan un lugar preeminente en la investigación científica mundial. Clínicamente, la EA se diferencia de la EP por presentar un deterioro intelectual progresivo que involucra no solamente la pérdida de las funciones de memoria, orientación y lenguaje sino que también trastorna otros componentes funcionales más complejos, como la personalidad, el juicio, la solución de problemas, la capacidad de cálculo, la habilidad para las construcciones visuoespaciales y un estado absoluto de dependencia mental y física,¹mientras que la EP se caracteriza por la manifestación de movimientos lentos del cuerpo, rigidez muscular, temblor y pérdida del equilibrio en la postura.²Patológicamente, la EA se caracteriza por la presencia de una atrofia cerebral grave y por la presencia de cinco marcadores típicos: marcada reactividad de la glía, significativo despoblamiento neuronal, gran cantidad de depósitos de hierro, de placas neuríticas (PN) y de ovillos neurofibrilares (ONF).^3,4 Notoriamente, el mayor componente de las PN es un fragmento proteínico denominado beta-amiloide (Aβ). Este péptido se genera por un proceso de digestión proteolítica por las secretasas α, β y γ a partir de su proteína precursora de amiloide (PPA). Así, el fragmento Aβ que mayoritariamente se produce en condiciones normales, contiene 40 aminoácidos (Aβ1-40), por la acción enzimática regulada de la β γ-secretasa. Sin embargo, un fragmento ligeramente largo de 42 a.a. (Aβ1-42) se genera por la acción enzimática anormal de la γ-secretasa.⁵ Justamente, mutaciones en los genes de la presenilina 1 (PS1), la presenilina 2 (PS2), y la PPA incrementan la producción exagerada del Aβ[1-42] en la EA de origen familiar (EAF). Es interesante destacar que, hasta el momento, el grupo familiar más numeroso del mundo con una mutación puntual en el gen de la presenilina 1 ha sido descrito en Colombia.⁶Esta mutación, denominada PS1-E280A, es el resultado de la sustitución del aminoácido ácido glutámico por el aminoácido alanina en el codón 280 de PS-1. Efectivamente, se demostró que esta mutación induce un incremento exagerado en la generación y acúmulo del Aβ[1-42] presentando una patología cerebral grave que conlleva finalmente a un inicio temprano o precoz (< 60 años) de la enfermedad.⁷Como resultado de esta patología genética, se prevé un aumento alarmante de nuevos casos con EA familiar en los próximos años, no solo en el departamento de Antioquia sino en todo el país. Por otra parte, la EP se caracteriza, patológicamente, por una degeneración selectiva de las neuronas dopaminérgicas de la región pars compacta de la sustancia negra, depósitos de hierro y la aparición de inclusiones eosinofilicas neurofilamentosas compuestas principalmente de la proteína α-sinucleína, denominados cuerpos de Lewis.^8,9 Debido a que un porcentaje significativo de pacientes manifiestan características clínicas y patológicas de Alzheimer y Parkinson,^10-13 es razonable pensar en la existencia de un mecanismo patogénico común entre las dos enfermedades. Sin embargo, hasta el presente, no se evidenciaron claramente cuáles son los eventos de señalización (moleculares, patológicos o de ambos tipos) que desencadenan la pérdida neuronal in vivo con manifestación propia a cada entidad neurológica, o con manifestación clínica-patológica mixta de ambas enfermedades.Durante los últimos años se propusieron varias hipótesis para tratar de explicar las causas de la pérdida y neurodegeneración de la región del hipocampo y de la sustancia negra en los pacientes con Alzheimer y Parkinson. No obstante, la hipótesis de mayor impacto y aceptación postula que estas enfermedades neurodegenerativas resultan de un proceso de estrés oxidativo ([EO] definido como un desequilibrio entre la producción excesiva de especies reactivas de oxígeno [ERO] tales como el ion súperoxido [^.O₂], peroóxido de hidrógeno [H₂O₂], radicales hidroxilo [OH], y la disminución o ausencia de los sistemas de respuesta antioxidante –enzimáticos o no enzimáticos– celulares). Este proceso de EO es generado por el péptido de A β[1-42] en la EA,¹⁴ o por toxinas endógenas o exógenas en EP,^15,16, respectivamente.Es de notar que hasta el presente, los mecanismos moleculares exactos que inducen muerte neuronal en los sistemas hipocámpico, catecolaminérgico y serotonérgico no han sido completamente establecidos. En este sentido, nuestro grupo de investigación se interesó por dilucidar los mecanismos de señalización celular que expliquen la pérdida neuronal en estos desórdenes neurodegenerativos, y con base en la hipótesis que propone que en la EA y la EP intervienen cascadas de eventos moleculares y patológicos comunes, seleccionamos linfocitos de sangre periférica (LSP) humana como modelo celular de estudio; como estímulos tóxicos elegimos el fragmento de Aβ[25-35], el cual es el dominio tóxico del péptido Aβ[1-42]; la 6-hidroxidopamina (6-OHDA), la 5,6-dihidroxitriptamina (5,6-DHT) y la 5,7-dihidroxitriptamina (5,7-DHT), las cuales son neurotoxinas selectivas de destrucción de los circuitos dopaminérgicos y serotoninérgicos, respectivamente. Adicionalmente, utilizamos la dopamina (DA) y algunos metales de transición (hierro, cobre, zinc y manganeso) como generadores de estrés oxidativo.En un trabajo previo Walkinshaw y Waters¹⁷ demostraron que la 6-OHDA inducía apoptosis (muerte celular programada, caracterizada morfológicamente por la reducción del volumen celular, condensación y fragmentación nuclear y formación de estructuras vesiculares o cuerpos apoptóticos¹⁸) en la línea neuronal PC-12. Este articulo, y una búsqueda cuidadosa en la literatura científica, nos indicó que eran inexistentes los informes que estudiaban los efectos tóxicos de la 6-OHA, 5,6-DHT y 5,7-DHT en un modelo único celular. Por lo tanto, con el objetivo de ampliar el conocimiento con estos estímulos tóxicos in vitro, y aprovechando la posibilidad técnica de evaluar directamente la morfología celular normal y apoptótica con la tinción de viabilidad naranja de acridina/bromuro de etidio (NA/BE), inicialmente logramos evidenciar que concentraciones crecientes (50, 150, 250 μM) de las toxinas dopaminérgicas y serotonérgicas inducían apoptosis (v. gr. 10%, 50% y 78%, respectivamente, con 6-OHDA) en LSP.¹⁹ Este resultado nos condujo a determinar si el efecto apoptótico tenía lugar por un mecanismo específico intracelular y si este efecto era dependiente de los productos de oxidación (quinonas y ERO) de dichas toxinas. Efectivamente, al emplear el inhibidor específico de transporte de monoamínas, la desipramina, y antioxidantes como ácido ascórbico, N-acetil-cisteína, 17β-estradiol, observamos una reducción de su efecto toxico comparable al observado con LSP sin ningún tratamiento (< 1% índice apoptótico). Estos resultados claramente mostraron que la acción nociva de estos estímulos tenía lugar en el interior de la célula y que requería un proceso de oxidación. Posteriormente, nos interesamos en investigar cuál era específicamente la especie reactiva de oxígeno generada durante el proceso de oxidación de estas neurotoxinas. De hecho, no fue una sorpresa encontrar que el H₂O₂ es la especie que mayoritariamente se genera en este proceso de oxidación, pero lo más interesante fue determinar cuál era la conexión entre el H₂O₂y la morfología apoptótica. Para dar respuesta a esta pregunta realizamos cuatro experimentos básicos: (1) determinamos la cinética de producción de H₂O₂por las tres toxinas y simultáneamente evaluamos la morfología de apoptosis; (2) inhibimos la acción de la proteasa caspasa-3, principal molécula ejecutora de muerte neuronal por apoptosis, utilizando el bloqueador especifico Ac-DEVD-cho; (3) también bloqueamos la síntesis de proteínas y del ARNm, utilizando los inhibidores actinomicina-D y cicloheximida, respectivamente; (4) finalmente, utilizando la técnica de reconocimiento por inmunohistoquímica, determinamos si los factores de transcripción como el factor nuclear kappa-B (NF-κB), p53 y c-Jun estaban implicadas como moléculas activas en el proceso de muerte programada.De acuerdo con este diseño experimental, logramos demostrar que la generación de H₂O₂es concomitante con la morfología típica de apoptosis, y que ésta depende de la activación de la caspasa-3. Además, logramos demostrar que la inducción apoptótica por parte de las toxinas/(H₂O₂) dependía de la síntesis de ARNm y proteínas de novo. Detectamos la activación simultánea de los factores NF-κB, p53, c-Jun asociada a morfología apoptótica en linfocitos expuestos a las neurotoxinas. Tomados en conjunto estos hallazgos nos permitieron concluir, primero, que la acción citotóxica, expresada en términos de porcentajes apoptóticos, de la 6-OHDA, la 5,6-DHT y la 5,7-DHT y por consiguiente la generación del H₂O₂dependía de la concentración y velocidad de oxidación de las toxinas; segundo, que el H₂O₂es una molécula que desencadena una cascada de eventos secuenciales conducentes a apoptosis, a saber: [6-OHDA, 5,6–DHT; 5,7-DHT] > quinonas + H₂O₂ > MAP quinasas > c-Jun, NF-κB > p53 > caspasa-3 > fragmentación nuclear del ADN. Finalmente, la dilucidación de los eventos moleculares comunes involucrados en la inducción de apoptosis por estas neurotoxinas, proporcionó nueva información en la comprensión de la muerte neuronal en la EP, y sugirieron que el estrés oxidativo juega un papel predominante en la patología de EP.Con los resultados anteriores y la observación de Behl y colaboradores²⁰ acerca de que el Aβ producía H₂O₂, nos incitó a determinar si el Aβ[25-35] podría causar efectos similares a los observados con la 6-OHDA.¹⁹ Mediante el empleo de técnicas de visualización de apoptosis, detección de H₂O₂, bloqueo de síntesis de novo de ARNm y proteínas; inhibición especifica de la caspasa-3; inhibición especifica del NF-κB con el bloqueante PDTC, detección de la activación nuclear del NF-κB por las técnicas de reconocimiento inmunohistoquímica y por el ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA), detección con inmunohistoquímica de la activación de p53 y c-Jun, logramos demostrar efectivamente que el péptido (10μM) Aβ[25-35] produce H₂O₂,²¹ y que a su vez este compuesto induce una cascada específica de señalización de muerte celular análoga a la descrita con la 6-OHDA, es decir, [Aβ(25-35)] > H₂O₂ > MAP quinasas> c-Jun, NF-κB > p53 > caspasa-3 > fragmentación nuclear = apoptosis. Es de hacer notar que algunas de estas moléculas o proteínas involucradas en esta señalización han sido corroboradas por las observaciones reportadas por McLlelan y col.,²² en las cuales detectaron la producción de H₂O₂ y radicales libres de oxígeno por las placas de Aβ in vivo en un modelo transgénico de Alzheimer y ex vivo a partir de tejido humano post mortem de Alzheimer; y por observaciones recientes en nuestro laboratorio que mostraron la activación de NF-κB, p53, c-Jun y Par-4 en tejido post mortem (in situ) de pacientes con Alzheimer.²³ Es más, en el trabajo mencionado,²¹ mostramos que (25μM) Fe²⁺ incrementó el efecto tóxico del Aβ de 2 a 5 veces en un intervalo de tiempo de 24 a 48 horas. Este incremento apoptótico resultó de la propiedad química del Fe²⁺ de potenciar el Aβ para la generación de ERO y la producción de radicales libres de oxígeno. Cabe destacar que el efecto nocivo del Aβ en presencia de Fe²⁺ fue independiente de la activación de NF-κB, p53 y c-Jun. Con estas observaciones logramos establecer un mecanismo operacional alternativo y modulado por el metal, en el cual, [Aβ > H₂O₂ + Fe²⁺ > ERO > caspasa-3 > fragmentación nuclear = apoptosis. En conclusión, tomadas en conjunto estas investigaciones^19,21 brindan una explicación del efecto nocivo de las neurotoxinas y el programa de activación molecular de muerte que se desencadena a partir de la molécula H₂O₂, en concordancia con las características típicas de apoptosis. Es de destacar que aunque la cascada de eventos moleculares inducidas por las neurotoxinas y el Aβ presentan características bioquímicas comunes, no se había establecido una relación directa entre estos eventos moleculares (estrés oxidativo) con los factores genéticos.Gracias a un estudio previo realizado en Colombia por Pineda-Trujillo y col.,²⁴en el cual se había descubierto una nueva mutación consistente en una sustitución de una cisteína por una tirosina en el codón 212 del gen de la parkina, en individuos provenientes de dos grupos familiares diagnosticados con la enfermedad de Parkinson juvenil autosómico recesivo (PJ-AR), nos interesamos en determinar la relación entre los factores genéticos y el impacto del estrés oxidativo en la PJ-AR. Con este propósito, y dado que los linfocitos expresan la isoforma 3 de la parkina,²⁵ una proteína comprometida en la regulación y degradación de las proteínas no plegadas resultantes de un proceso de estrés, seleccionamos 3 pacientes homocigotos recesivos (C212Y), un paciente heterocigoto (C212Y/C), y cuatro individuos normales (C212C). Efectivamente, logramos establecer que la mutación C212Y causa una sensibilidad aumentada en los linfocitos de los pacientes homocigotos recesivos al estrés oxidativo generado por los estímulos tóxicos de H₂O₂, Fe²⁺, DA comparados con linfocitos de pacientes heterocigotos o normales.²⁶Adicionalmente, evidenciamos que la DA induce apoptosis por cuatro vías moleculares alternativas conducentes a la activación de la caspasa–3: (1) una vía dependiente del NF-κB; una vía dependiente de alteración mitocondrial (2) por exposición al H₂O₂ o (3) por exposición a radicales de (OH); y (4) una vía por incremento de las proteínas no plegadas inducidas por estrés. Estos hallazgos muestran por primera vez que los factores genéticos, los factores ambiéntales y el Fe²⁺ influyen de manera determinante en la enfermedad de PJ-AR. Curiosamente, el acúmulo de Fe²⁺ en el cerebro es una característica neuropatológica notable en la enfermedad de PJ-AR²⁷ similar a la observada en la EA⁴ y la EP⁹.Evidentemente, esta característica sugiere que el Fe²⁺ juega un papel central en la patogénesis de estas enfermedades. Sin embargo, no se ha dilucidado claramente si el Fe²⁺ constituye una causa primaria o secundaria en el deterioro neuronal en estas enfermedades; si la toxicidad del Fe²⁺ se debe a alteraciones en su metabolismo o cuál es su mecanismo de toxicidad. Por lo tanto, nos interesamos en investigar el mecanismo citotóxico del Fe²⁺ en el modelo de LSP.²⁸ Adicionalmente, evaluamos otros metales como Cu²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺ involucrados en otras neuropatologías. Con este propósito, LSP fueron expuestos a concentraciones crecientes (50, 100, 250, 500,1 000 μM) de estos metales. Usando el análisis morfológico con la tinción NA/BE, logramos observar que 500 μM de los metales provoca un porcentaje máximo de apoptosis (22% a 30%) y un porcentaje mínimo de necrosis (3% a 7%). Por otra parte, concentraciones menores de 500 μM fueron inocuas, mientras que 1 000 μM provocaron necrosis principalmente (> 40%).²⁸ Estos resultados nos permitieron seleccionar la concentración de 500 μM para los siguientes experimentos. De hecho, esta concentración utilizada como estímulo deletéreo es comparable con los niveles de metales reportados in situ en las placas de los cerebros provenientes de pacientes con EA (v. gr. 1 mM Fe²⁺) y en la región de la sustancia negra de los cerebros con EP (v. gr. 13 a 15 μg de Fe²⁺/ por peso de tejido seco). Con este procedimiento experimental evidenciamos por primera vez que los metales inducen apoptosis en LSP a través de la producción de H₂O₂ y radicales hidroxilo (OH), los cuales causan despolarización mitocondrial, activación de la caspasa-3 y fragmentación nuclear independientemente de la activación de los factores de trascripción NF-κB y p53. Estos datos sugieren efectivamente que los metales podrían constituir la causa primaria de los procesos neurodegenerativo en EA y EP, iniciada por una generación de H₂O₂per se por los estados activos de óxido-reducción de los metales y ^.OH formados por la reacción de Fenton. Además, estos hallazgos ilustran la importancia de LSP como modelo de búsqueda para las estrategias antioxidantes que remuevan H₂O₂/OH asociadas con las reacciones catalizadas por metales en las enfermedades neurodegenerativas.

Modelo molecular unificado de estrés oxidativo en las enfermedades de Alzheimer y Parkinson.(1) El beta amiloide (Aβ[25-35], 10 μM) y la autoxidación de la dopamina (DA, 1mM) producen peróxido de hidrógeno (H₂O₂). Esta molécula puede indirectamente (2) activar el factor nuclear kappa-B (NF-κB), a través de la activación de la proteína p21-ras²⁹ y de las MAP quinasas,³⁰ el cual se traslada al núcleo y transcribe la proteína p53 (3), que a su vez, transcribe la proteína proapoptótica Bax, la cual induce la liberación del citocromo C y la subsiguiente activación de la caspasa-3 (4), fragmentación nuclear y apoptosis (5). Alternativamente, el H₂O₂ puede directamente actuar sobre la membrana mitocondrial (6) permitiendo la liberación del citocromo C, activación de la caspasa-3 y apoptosis. Por otra parte, el H₂O₂ puede generarse a partir de las reacciones catalizadas por (25 μM) hierro (Fe²⁺) al reaccionar con el oxígeno molecular (7) y promover la oxidación de la dopamina en productos de oxidación, quinonas (8), las cuales forman conjugados con proteínas (9) con actividad de óxido-reducción cíclica (10); o puede generarse por (500 μM) del metal per se (11). Una vez formado el H₂O₂, éste reacciona con el Fe²⁺ para originar radicales de hidroxilo (OH). Estos radicales causan un doble efecto: actúan directamente sobre la membrana mitocondrial permitiendo la liberación del citocromo C, e induciendo el proceso apoptótico (12); o pueden alterar la estructura terciaria del plegamiento de las proteínas (13), las cuales son degradadas normalmente por el sistema proteico proteosomal de ubiquitinización (14). Sin embargo, si el sistema de eliminación de las proteínas no plegadas por el sistema proteico proteosomal de ubiquitinizacion está deficiente o alterado por mutaciones (v. gr. mutaciones en la ligasa E3, parkina) (15), el exceso de proteínas no plegadas induce daño directo mitocondrial y apoptosis.

En resumen, estas investigaciones^19,21,23,28 sugieren que las enfermedades de Alzheimer y Parkinson comparten un mecanismo común de señalización molecular de muerte neuronal y que el H₂O₂es una molécula cardinal desencadenante del proceso neurodegenerativo. Actualmente, nuestra hipótesis de trabajo, titulada "Mecanismo molecular unificado de estrés oxidativo en las enfermedades de Alzheimer y Parkinson", describe un posible escenario que explica los eventos fundamentales que conllevan apoptosis neuronal en estas enfermedades (véase Figura 1). Finalmente, dado que hasta el momento no existen terapias efectivas contra estos desórdenes neurológicos, en el presente investigamos sustancias o compuestos de origen vegetal con propiedades químicas antioxidantes utilizando el modelo propuesto. Consideramos que esta información permitirá una mejor aproximación racional en los diseños terapéuticos que detengan o retarden las causas de deterioro neuronal en los pacientes que padecen estas devastadoras patologías. ReconocimientosLos autores desean expresar su agradecimiento a las entidades Comité para el Desarrollo y la Investigación (CODI) Universidad de Antioquia, proyecto código CODI #9831; #9961, y a Colciencias, proyecto código #1115-04-10231.Los autores no manifiestan conflictos.

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