Introducción
El carcinoma endometrial es la neoplasia invasora más común del tracto genital femenino y es la séptima causa de muerte por patologías oncológicas. Cerca de 39 300 nuevos casos se diagnostican anualmente, con un resultado de más de 6 600 muertes en los EE.UU. [1]. La cantidad de pacientes con carcinoma endometrial ha crecido en Japón de modo constante en los últimos años, por lo cual la comprensión de las características biológicas de éste tumor es cada vez más importante. El carcinoma endometrial es un típico tumor hormonodependiente, y se cree que las hormonas esteroides ejercen un importante papel en la patogénesis y desarrollo tumorales.[2,3] Dado que estos fenómenos vinculados a las hormonas son evocados a través de sus receptores específicos, es importante explorar los patrones y mecanismos de expresión de los receptores esteroides. Se ha señalado que los receptores estrogénicos (ER) se expresan ampliamente en las glándulas endometriales proliferativas normales, pero que se encuentran inhibidos en un subgrupo de carcinomas endometriales.[4-8] La pérdida de la expresión ER en el carcinoma endometrial se relaciona con la independencia de la regulación hormonal, la refractariedad a las terapias hormonales, y se comporta como marcador de subtipos clínicamente agresivos.[4-8] Así, es imperioso investigar los mecanismos inhibitorios de los receptores esteroides. Recientes estudios revelaron que la metilación de las citosinas ubicadas en las islas CpG (CpGs; área rica en citosina y guanina), localizadas en el promotor de varios genes, se encuentra profundamente involucrada en la supresión de la trascripción génica.[9-11] En el presente artículo se revisan estudios acerca de la correlación entre la expresión del ER y la metilación del gen ER para comprender los mecanismos inhibitorios de este receptor en el carcinoma endometrial.

Crecimiento inducido por estrógenos y supresión del crecimiento inducida por progestágenos en el endometrio normal y en el carcinoma endometrial
El crecimiento de las glándulas endometriales humanas es controlado estrictamente por los estrógenos y la progesterona.[12] Los estrógenos estimulan la proliferación de las células glandulares y estromales, mientras que la progesterona suprime el crecimiento e induce cambios secretorios de las células glandulares, provocando –además- cambios deciduales en las células del estroma. Se piensa que estos cambios son llevados a cabo a través de sus receptores específicos.[12] El mecanismo de crecimiento inducido por los estrógenos ha sido investigado en términos de simulación de la expresión del ER,[13,14] de enzimas metabolizadoras de estrógenos[15] y de mecanismos autocrinos/paracrinos mediados por factores de crecimiento.[6] Sin embargo, no se sabe mucho acerca de los mecanismos intercelulares que promueven directamente el crecimiento celular en el endometrio normal. Nosotros examinamos el mecanismo de crecimiento inducido por estrógenos en las glándulas endometriales normales respecto de los reguladores del ciclo celular, dado que las expresiones e interacciones de las moléculas vinculadas con el ciclo celular, tales como las ciclinas, quinasas dependientes de ciclinas (cdks) y los productos del gen supresor de tumores, son esenciales para la progresión del ciclo celular.[17,18] mostramos que los estrógenos inducían la expresión secuencial de ciclinas en las células glandulares endometriales normales cultivadas; por ejemplo, la expresión de la ciclina D1 fue observada por primera vez 4 horas después de la estimulación con estradiol (E2) y fue seguida serialmente por la expresión de las ciclinas E, A y B1. Además, la estimulación inducida por E2 de la ciclina D1 fue mediada por c-Jun. En las células de carcinoma endometrial ER-positivo (Ishikawa), se observó también la estimulación inducida por E2 de la ciclina D1, pero ella fue mediada por mecanismos distintos de aquellos presentes en las glándulas endometriales normales. Además, demostramos que la supresión del crecimiento inducida por progesterona de las glándulas endometriales normales y las células PR-positivas del carcinoma endometrial (células de Ishikawa) es mediada por un inhibidor cdk, p27.[19,20]

Subtipos ER y PR y sus expresiones en el endometrio normal y el carcinoma endometrial
Los ER tienen dos isoformas funcionales, ER alfa y ER beta. Los genes para el ER alfa se encuentran localizados en el locus cromosómico 6p25.1[21,22] y los genes del ER beta en el cromosoma 14q22-24.[23] En el endometrio normal se observa que la expresión del ER alfa es predominante respecto de la del ER beta.[24-26] En la fase proliferativa, casi todas las células glandulares expresan ER alfa, mientras que su expresión disminuye en la fase secretoria. El porcentaje de células positivas para ER alfa en las fases secretorias temprana, media y tardía es aproximadamente de 30%, 5% y 1%.[13,27] En contraste, la expresión del ER beta se observa principalmente en las células glandulares, pero su localización e intensidad son limitadas.[24-26] Se cree que la disminución de la expresión del ER alfa en la fase secretoria obedece al aumento de los niveles séricos de progesterona[12] aunque, sin embargo, los mecanismos de la inhibición inducida por progesterona del ER alfa no son completamente comprendidos. Se considera que la más importante función del ER alfa es la estimulación de la proliferación celular, tanto en el endometrio normal como maligno,[12] mientras que la función del ER beta en el endometrio no se comprende. Los receptores para la progesterona (PR) tienen también dos isoformas principales, PR-A y PR-B.[28,29] Estas dos formas son expresadas por un único gen y son consecuencia de la trascripción de promotores diferentes.[28,29] PR-A y PR-B se expresan en cantidades aproximadamente iguales en los tejidos endometriales.[30,31] En las glándulas endometriales normales, el patrón de expresión de PR-A y PR-B es similar al del ER alfa; por ejemplo, la mayoría de las células glandulares son positivas para PR-A y PR-B en la fase proliferativa, pero la expresión de ambos se encuentra marcadamente disminuida en la fase secretoria.[27,30] La función del PR-B ha sido extensamente estudiada en varias células; sin embargo, los estudios acerca del PR-A son limitados.

Se ha descrito la expresión de ER alfa y ER beta en carcinomas endometriales.[32,33] La expresión del ER alfa, que es positiva en la mayoría de las células glandulares del endometrio proliferativo normal, se encuentra a menudo preservada en el carcinoma endometrial, especialmente en los tumores de bajo grado histológico. Por otra parte, la expresión del ER alfa se pierde en la mayoría de los carcinomas de alto grado. Además, aun en tumores de bajo grado con expresión ER alfa, la expresión de este último tiende a ser suprimida durante la progresión del tumor.[2,8] La falta de expresión del ER alfa en el carcinoma endometrial es clínicamente importante, dado que los tumores ER alfa negativos son refractarios a las terapias hormonales, crecen rápidamente y se caracterizan por los pobres resultados clínicos que logran las pacientes, en comparación con los tumores ER alfa positivos.[8] Se ha comunicado la expresión del ER beta en el carcinoma endometrial. Utsunomiya y colaboradores informaron que puede observarse expresión de ARNm para ER beta en aproximadamente 36% de los tejidos carcinomatosos endometriales examinados; sin embargo, no existieron correlaciones con los marcadores de crecimiento y los parámetros clínico-patológicos.[32] Takama y colaboradores informaron que la elevación de la tasa ARNm para ER beta/ARNm para ER alfa correlacionaba con la invasión miometrial.[33] Sin embargo, a diferencia del ER alfa, el patrón de expresión y la significación del ER beta no han sido completamente establecidos.

Compromiso de la metilación de las islas CpG en la regulación de la trascripción génica
La región promotora y ciertos genes a menudo contienen áreas ricas en citosina y guanina, llamadas islas CpG (CpGs). La metilación de la citosina, especialmente en las CpGs, produce la supresión de la trascripción del gen.[9,10] Debido a que esta supresión es producida sin alteración alguna de las secuencias de ADN, tales como mutaciones y deleciones, este cambio es llamado epigenético.[34,35] Se comunicó la metilación de los promotores en varios genes. Los receptores esteroideos tales como ER, PR y los receptores androgénicos son moléculas representativas cuya expresión es susceptible de regulación por metilación CpG de sus propios genes.[36,37] Los reguladores del ciclo celular son también blancos de la metilación CpG. Se informó la reducción de la expresión de los promotores inducida por la metilación del producto del gen del retinoblastoma (Rb; un importante supresor tumoral) en retinoblastomas.[38] Se señaló la pérdida de p16^INK4, un inhibidor de las quinasas dependiente de ciclinas (cdk), a través de la metilación del promotor, en neoplasias ginecológicas, especialmente en carcinomas endometriales y cervicales avanzados.[39] Se informó también la reducción de la expresión de la ciclina D1, un regulador positivo de la fase G1, debido a la metilación del promotor, en la capa basal de las células uterinas de ratas; esto podría explicar el limitado potencial de crecimiento que muestra la capa basal del endometrio.[40] Además, la expresión del gen hMLH1, un gen reparador de errores de concordancia en el ADN, es regulada por metilación del promotor.[41,42] Se sabe que la hipermetilación del gen hMLH1 reduce la expresión del ARNm y la proteína para hMLH1; ello produce aumento de la inestabilidad del microsatélite, lo cual puede ser un evento temprano de la carcinogénesis endometrial.

Se piensa que la metilación de CpGs es mediada por ADN metiltransferasas,[43,44] varios subtipos de estas enzimas han sido identificados. Las metiltransferasas 3a y 3b poseen potentes actividades metilatorias de novo, mientras que la metiltransferasa 1 tiene una función de "mantenimiento" de la metilación más poderosa, en comparación con la actividad de metilación de novo. [45,46] Sin embargo, aún deben dilucidarse las especificidades de substrato y los mecanismos regulatorios de estas metiltransferasas. La supresión de la trascripción inducida por metilación es atribuida a la metilproteína de unión a la citosina (MeCPI), a las citosinas metiladas y a los subsiguientes cambios conformacionales que inhiben la trascripción.[47-49] Se ha dicho que la supresión de la trascripción correlaciona con la densidad de metilación de las CpGs.[48,49]

Promotor del gen ER y detección de la metilación del gen
Respecto de la estructura del promotor del gen ER, el ADN promotor del ER alfa humano abarca desde +163 (desde el punto inicial de transcripción) hasta -15 kb cadena arriba del gen ER alfa,[51-52] y esta área contiene al menos siete regiones promotoras (llamadas A, B, C, D, E, F y T). Se ha descrito también la utilización de promotores específicos de los tejidos. Por ejemplo, se ha comunicado la utilización de los promotores A (que abarca desde +1 hasta +163), B (-170 hasta -321), y C (-1859 hasta -3067) en células de carcinoma endometrial.[53,54] Más de 60 sitios CpG fueron identificados junto con estas tres regiones promotoras. Además de estas últimas, existen varios sitios CpG localizados en un área que abarca desde +290 hasta +490 en la región modificadora del exón 1.[50] Es importante destacar que los sitios CpG localizados en esta área se encuentran incluidos en secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción específicas de metilación tales como HhaI y HpaII.

Se desarrollaron varias técnicas para detectar la metilación de las islas CpG en la última década. En los comienzos de los '90, la detección de la metilación del gen ER era llevada a cabo por enzimas de restricción sensibles a la metilación, tales como Hha1 y HpaII, en combinación con el análisis por Southern blot. Las enzimas de restricción específicas de metilación, tales como Hha1 y HpaII logran que, cuando las citosinas ubicadas en CpG y localizadas en puntos de clivaje específicos de las enzimas son metiladas, la enzima no puede cortar el ADN. Así, el patrón de digestión del genoma ADN por parte de estas enzimas difiere entre aquellas que contienen citosina metilada y citosina no metilada en los CpG ubicados en los sitios de reconocimiento. La diferencia del ADN luego de la digestión fue detectada mediante prueba de Southern blot. La metilación del gen ER fue ampliamente estudiada en carcinomas mamarios utilizando esta técnica. Piva y colaboradores describieron la difusa hipometilación del terminal 5' del gen en carcinomas mamarios con alto contenido de ER, e hipermetilación en carcinomas sin ER.[55] Ottaviano y colaboradores demostraron que las líneas celulares de carcinoma mamario negativas para ER alfa poseen mayor capacidad para metilar ADN, y que muestran amplia metilación de las islas CpG en la región 5' del promotor del gen ER, lo cual correlacionaba con el silenciamiento de la expresión del ER.[56] Lapidus y colaboradores señalaron que las islas CpG ubicadas en la región 5' del ER se encontraba metiladas en tumores ER negativos, pero no estaban metiladas en los ER positivos.[57] Pese a que esta técnica es racionalmente simple, requiere cantidades relativamente grandes de ADN, y la experimentación utilizando secciones de tejido fijadas en formalina y embebidas en parafina es dificultosa. Para resolver este problema, nosotros desarrollamos un método para detectar la metilación de una isla CpG localizada en la secuencia de clivaje de la enzima de restricción en el exón 1 (+290 hasta +490), utilizando digestión por enzimas de restricción sensitivas a la metilación, y la siguiente reacción en cadena de la polimerasa (PCR).[58] Esta técnica requiere cantidades relativamente pequeñas de ADN genómico, lo cual permitió analizar la metilación en especímenes in vivo extraídos de secciones de tejido embebidas en parafina. Además, se aplicaron recientemente varias técnicas utilizando bisulfito de sodio y el siguiente secuenciamiento directo, o técnicas PCR específicas para metilación. En estos métodos, el ADN genómico fue tratado primero con bisulfito de sodio, lo cual cambia la citosina no metilada a timidina, pero no la citosina metilada. Los cambios en la secuencia inducidos por el bisulfito de sodio fueron detectados por la siguiente secuencia directa. Esta técnica permitió detectar metilaciones CpG existentes en amplias regiones del ADN genómico; sin embargo, el procedimiento de secuenciamiento demanda mucho tiempo y esfuerzo. Para mejorar esta limitación, se desarrolló un tratamiento con bisulfito de sodio seguido de técnicas de PCR específicas para metilación.[59] En esta técnica, la PCR fue realizada utilizando iniciadores diseñados para reconocer específicamente citosina metilada o timidina originadas por el tratamiento con bisulfito. Esto permitió examinar la metilación en varios sitios con menos trabajo experimental, y ha sido ampliamente utilizada en este campo debido a su relativa simplicidad técnica. Sin embargo, este método tiene limitaciones en cuanto al diseño de iniciadores específicos, así como en cuanto a su capacidad para detectar metilación sólo en las CpGs de los sitios iniciadores. Archery y colaboradores informaron, en carcinomas mamarios, el aumento de la metilación CpG del gen ER en cánceres mamarios ER-negativos vinculados al BRCA-1, utilizando técnicas PCR metilación-específicas.[60]

Metilación del gen ER y su correlación con la expresión ER en el carcinoma endometrial
Nosotros investigamos la metilación de las islas CpG localizadas entre +290 y +490 en el exón 1 del gen ER alfa en células endometriales (Ishikawa) ER alfa-positivas y en líneas celulares de carcinoma mamario (MCF-7), utilizando la técnica antes mencionada.[58] Los resultados indicaron que las citosinas no se encontraban metiladas en los sitios de reconocimiento de Hha1 y HpaII de las islas CpG de estas células. Por el contrario, ambos sitios se encontraban metilados en las líneas celulares de carcinoma endometrial ER alfa-negativas (KLE) y de cáncer mamario (MDA-MB-231). Luego examinamos tejidos fijados en formalina y embebidos en parafina, obtenidos de 25 casos de carcinoma endometrial; se halló metilación del gen ER alfa en el sitio HpaII, o en ambos sitios Hha1 y HpaII en 6 casos, mientras que no se halló metilación en los restantes 19 casos.

Histoquímicamente, 5 de los 6 casos con metilación fueron negativos para la expresión del ER alfa, mientras que 14 de los 19 casos sin metilación fueron positivos para el ER alfa (p = 0.02). Así, nosotros concluimos que la metilación de las islas CpG del gen ER alfa se correlaciona inversamente con la expresión ER alfa en el carcinoma endometrial.

Respecto de la expresión ER y la metilación génica en los carcinomas endometriales, Hori y colaboradores informaron el estado de metilación de dos regiones promotoras del gen ER alfa y la expresión de proteína ER alfa.[53] Ellos estudiaron la metilación de los sitios HpaII, NotI y SacII en la región promotora distal a la cual corresponde el antes mencionado promotor B del ER alfa, y la misma región del exón 1, tal como examinamos nosotros. Ellos mostraron que la metilación del sitio HpaII en ambas áreas se encontraba presente en 13 de 38 carcinomas endometrioides, mientras que no se identificó metilación en los sitios NotI y SacII. Ellos concluyeron que la metilación del gen ER alfa no se correlacionaba con expresión ER alfa en los carcinomas endometriales. Sin embargo, los autores no examinaron la presencia o ausencia de metilación en el sitio HhaI, que podría ser importante para la represión de la expresión ER. Evaluaron la expresión del ER por enzimoinmunoensayo utilizando muestras de tejido homogeneizadas, las cuales podrían haber producido falsos positivos debido a contaminación de células ER-positivas, estromales o miometriales.

Navari y colaboradores estudiaron también la correlación entre la metilación del gen ER alfa y la expresión de la proteína ER utilizando varias técnicas PCR específicas de metilación y tratamiento con bisulfito de sodio.[61] Examinaron la amplia metilación de una región de 600-bp en el terminal 5' del gen ER alfa, en ADN extraido de dos líneas celulares de carcinoma endometrial ER alfa-negativas (KLE y Hec-1-A) y en ADN microdisecado de tejidos de carcinoma endometrial fijado en formalina y embebido en parafina, en los cuales la expresión ER había sido confirmada como negativa por inmunotinción. Los resultados indicaron que las dos líneas celulares de carcinoma endometrial ER alfa-negativas mostraban extensos sitios de metilación en el área 5' del gen ER, las cuales incluían los mismos sitios CpG examinados por nosotros. Este resultado fue consistente con nuestro resultado, lo que sugiere que la metilación del gen ER alfa funciona como un represor in vivo de la transcripción. Sin embargo, ninguna de las 55 CpGs se encontraba metilada en los carcinomas endometriales ER alfa-negativos ni en el endometrio normal ER alfa-positivo. Este resultado sugiere que el estado de metilación no afecta la expresión del ER alfa en el carcinoma endometrial in vivo.

Sasaki y colaboradores informaron correlación entre el estado de metilación de tres promotores ER alfa (ER alfa-A, alfa-B y alfa-C, como fue descrito previamente), y entre el estado de metilación del promotor ER beta y la expresión de los correspondientes transcritos, por ejemplo, el ARNm para ER alfa-A, alfa-B, alfa-C y ER beta, en líneas celulares de carcinoma endometrial ER alfa positivos, y en tejidos fijados en formalina y embebidos en parafina, utilizando PCR específica de metilación y RT-PCR.[54] Ellos informaron que, en las líneas celulares de carcinoma endometrial, la expresión del ARNm para ER alfa-A y del ARNm para ER alfa-B, era positiva sin metilación de los respectivos promotores, mientras que la expresión del ARNm para el ER alfa-C era negativa con promotor ER alfa-C metilado. Estos resultados sugieren que la metilación del gen ER parece actuar como supresor de la transcripción. Respecto de la metilación en tejidos fijados en formalina y embebidos en parafina, mostraron que los tres promotores carecían de metilación en todos los tejidos normales. Además, los promotores ER alfa-A y alfa-B no se encontraban metilados en la mayoría de los carcinomas endometriales, pero en la mayoría de los casos (94%) el promotor ER alfa-C sí se encontraba metilado. Sin embargo, dado que no existía información disponible respecto de la expresión de transcritos de ER alfa-A, alfa-B y alfa-C en los casos de carcinoma, no se evaluó la correlación entre el estado de metilación y la expresión. Debe tenerse en cuenta también que las CpGs de los tres promotores por ellos investigados fueron diferentes que las examinadas por nosotros en nuestros estudios.

En general, existe en la actualidad un número limitado de informes respecto de la metilación del gen ER y su expresión en los carcinomas endometriales. Entre estos informes, los sitios CpG examinados, los métodos empleados y los resultados obtenidos son muy diferentes entre sí. El consenso es que: 1) el promotor ER alfa, independientemente de sus sitios CpG, se encuentra a menudo metilado en las líneas celulares de carcinoma endometrial ER alfa-negativas, y viceversa; 2) no se observó metilación en el endometrio normal. Sin embargo, es difícil llegar a una conclusión respecto de la correlación entre la metilación ER alfa y la expresión en los carcinomas endometriales; pese a que nuestros datos mostraron una significativa correlación entre la metilación del gen ER alfa y su inhibición, los resultados provenientes de otros estudios difieren de los de nuestro informe. La razón exacta de la discrepancia es desconocida actualmente, y una posible explicación podría ser la diferencia de enfoques técnicos y sitios CpG examinados.

Resumen
Recientes investigaciones revelaron que el cambio epigenético mediado por la metilación de CpGs se vincula profundamente con el desarrollo embrionario y la carcinogénesis de varios tumores. Además, la disminución de la expresión mediada por la metilación del ER alfa parece estar indicada en las células de carcinoma endometrial y de carcinoma mamario. Sin embargo, parece que existen todavía algunas discrepancias entre los resultados de diferentes estudios. Así, el mejoramiento de las tecnologías podría contribuir a llevar la situación actual hacia una más concreta. Además, los objetivos futuros serán examinar si la metilación de ciertas CpGs críticas podría comportarse como un factor importante en la represión trascripcional del gen ER alfa, y evaluar cuán profundamente podría estar involucrada la densidad de la metilación en la supresión de la transcripción, especialmente en tejidos in vivo. Además, pese a que se considera que la metilación de CpGs es generalmente evocada por las metiltransferasas, los mecanismos que explicarían por qué estas enzimas son activadas durante la transformación maligna de las células permanecen aún sin dilucidar. Se necesitan mayores investigaciones para aclarar estas cuestiones.