VALORACION ESTADISTICA DEL TEST DE ESTIMULACION NERVIOSA REPETITIVA

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Introducción
Los trastornos de la transmisión neuromuscular se clasifican en tres grandes grupos (Oh 1992): (1) postsinápticos (por ejemplo, miastenia gravis [MG]); (2) presinápticos (por ejemplo, síndrome miasteniforme de Eaton-Lambert [SMEL] y botulismo); (3) pre y postsinápticos (por ejemplo, síndrome miasténico inducido por antibióticos). El test de estimulación nerviosa repetitiva (ENR) es una prueba de referencia estándar, junto con el análisis de fibra única (EMGFU), en el diagnóstico de trastornos de la transmisión neuromuscular (TNM), incluso aunque están disponibles otros test diagnósticos como la determinación de anticuerpos antirreceptor de acetilcolina (AchR-ab) o anticanal de calcio tipo P/Q (Oh y cols, 1982; Stälberg, Sanders 1981; Oh 1992; Katirji, Kaminski 2002; Tsao y cols 2002). Puede detectar anomalías en 55% a 77% de los pacientes con MG y en 100% de los casos de SMEL o botulismo sintomático. Permite distinguir entre las anomalías pre y postsinápticas y el grado de severidad del proceso. Es una prueba menos sensible que la EMGFU, pero resulta más específica, más sencilla y menos molesta para el paciente (AAEM 2001b). Consiste en una sucesión de potenciales de acción musculares compuestos (PAMC), obtenidos por medio de la estimulación nerviosa supra-umbral. El PAMC es la suma temporo-espacial del potencial de acción de las fibras musculares inervadas por el nervio estimulado (Katz 1966). Habitualmente se utiliza la medición de la amplitud de desviación negativa de PAMC en lugar del área, aunque la medida más exacta sería el área bajo la porción negativa de PAMC (Stälberg 1980, Pickett 1980). La amplitud del pico negativo es menos fiable que la determinación del área como activación de las fibras musculares (Chauplannaz, Bady 1995).Generalmente suele emplearse la razón de la amplitud (Chauplannaz, Bady 1995; Kimura 1989; Oh, et al 1992) o el área (Lo et al 2003) del cuarto o quinto potencial con respecto al primero PAMC (V₄/V₁ o V₅/V₁, respectivamente) como criterio para definir la normalidad o la presencia de patología en la transmisión neuromuscular (AAEM 2001a). Desde un punto de vista práctico, sería deseable tener un criterio de corte para establecer la existencia de patología mejor definido.Con el objeto de encontrar este criterio, se han estudiado algunas propiedades estadísticas del test ENR, comparando las medidas de amplitud (normalmente empleadas), área (de uso menos común) y las tendencias de series de PAMC en los que se determinó la amplitud o el área. Desde un punto de vista matemático, se asumió que el ENR se comporta como una sucesión tiempo-dependiente de PAMC ajustable a una recta de regresión (cuya expresión es y = m·x + b) en personas sin patología.Incluso desde un punto de vista del estudio fisiológico, la aproximación de medidas de tendencias, en lugar de medidas puntuales, tendría gran importancia, dado que el test de ENR, en realidad, mide las variaciones de voltaje o área de una sucesión temporal. Por ello, el conocimiento de la dinámica de la unión neuromuscular se beneficiaría con el test que permitiera valorar la dinámica temporal del sistema en lugar de limitarse a establecer un criterio puramente fenomenológico de normalidad/anormalidad.Puede demostrarse, siguiendo todas estas reflexiones, que las regresiones lineales de las medidas de área y voltaje son excelentes parámetros para valorar el test de ENR desde un punto de vista estadístico.Material y métodos
Pacientes
Se estudiaron treinta voluntarios sanos (13 hombres y 17 mujeres) que no presentaban ningún síntoma de enfermedad de transmisión neuromuscular conocida. A todos los pacientes se les explicó la mecánica y sentido del estudio y todos ellos dieron su consentimiento verbal. Los pacientes fueron estudiados mientras permanecían tumbados y con el antebrazo derecho inmovilizado por un técnico. La estimulación se llevó a cabo por medio de un par de electrodos de superficie separados dos centímetros, colocados en la muñeca, sobre el trayecto del nervio cubital a la altura de la muñeca. Se garantizó que el electrodo de estimulación permanecía en el mismo lugar durante todo el registro, inmovilizándolo con una banda elástica adhesiva. Los electrodos de registro se colocaron en el músculo abductor del quinto dedo (AQD) de la mano derecha, fijándolos fuertemente por medio de esparadrapo, con el electrodo activo colocado en la porción media del vientre del músculo y electrodo pasivo sobre el tendón distal (Oh 1992). En todos los casos se mantuvo la temperatura de la piel por encima de 32 °C (Oh 1992; Borenstein, Desmedt 1973; Rutkove 2001).Protocolo de estudio
El protocolo consistió en cinco trenes de 10 estímulos de 0.1 ms de duración e intensidad supramaximal de 20% a 30%, mientras se registraban los PAMC. Inicialmente, se emplearon tres trenes a 3 Hz (estimulación de baja frecuencia, EBF), seguidos por trenes a 10, 15 y 20 Hz (estimulación de alta frecuencia, EAF). No se estudiaron frecuencias por encima de 20 Hz para no inducir dolor. El tiempo transcurrido entre dos trenes consecutivos era superior a 1 min. Durante todo el protocolo, se verificó la forma del PAMC.Los registros de PAMC fueron adquiridos y almacenados por medio de un aparato de EMG marca Keypoint® (Dantec®). Los análisis off-line se realizaron con software científico comercial (Sigma Stat® 1.0, Sigma Plot® 2.01 y Scientific Notebook®).Medidas realizadas
Se determinó el área (mV·ms) y amplitud (mV) de todos los PAMC. Los primeros PAMC (V1) se tomaron como referencia (100%) y el resto se normalizó a dichos potenciales. La sucesión tiempo-dependiente de área y voltaje se ajustó a una regresión lineal y para ello se emplearon las siguientes expresiones

donde el x_c y <>y_c son las coordenadas del centro de gravitación.Estas expresiones corresponden a los parámetros que definen una línea recta

El error absoluto en medidas directas se tomó como la precisión del aparato (ΔV = 0.1 mV para el voltaje y Δt = 0.1 ms para el tiempo). El error absoluto en medidas derivadas se determinó empleando la teoría de errores propagados. Por ejemplo, el área (A) no fue medida directamente, sino que su valor se determinó a partir de la siguiente expresión

Donde t₁y t₂son el tiempo de comienzo y finalización respectivamente de la parte negativa de PAMC. Por supuesto, esta expresión es sólo válida para las funciones analíticas, pero muestra que el área depende del voltaje y del tiempo [A = f(V,t)]. Por consiguiente, el error absoluto del área (&DeltaA) será

Además, operando las derivadas parciales, se obtiene

La normalización no introduce más incertidumbre en medidas del área. Así, ΔA ≈ 1.5 mV·ms para los resultados obtenidos.Con estas medidas de área (denotadas por a) y voltaje (denotadas por V), los parámetros usados para la valoración del ENR han sido

Cociente de la medida de área entre el cuarto y el primer PAMC normalizados (V₄/V₁(a)). El resultado es adimensional, al tratarse de un cociente.
Cociente de la medida de voltaje entre el cuarto y el primer PAMC normalizados (V₄/V₁(V)). Adimensional.
Pendiente de la recta de regresión para la sucesión de medidas de área de PAMC normalizados [m(a)]. También se trata de un número adimensional.
Pendiente de la recta de regresión para la sucesión de medidas de voltaje de PAMC normalizados [m(V)]. Adimensional.

La simetría de los límites de normalidad para las distintas frecuencias se ha determinado como el valor absoluto del cociente entre el límite superior y el límite inferior, para la frecuencia considerada. Cuando los límites son simétricos, el valor obtenido es igual a 1, de modo que cuanto más se aleje de la unidad, mayor será la asimetría entre los límites superior e inferior.Estadística
Los cuatro parámetros de comparación (V₄/V₁ y m, ambos para el área y voltaje) se estudiaron para la dependencia de edad y sexo empleando para ello la regresión lineal y el coeficiente de correlación.Aunque el número de personas estudiado era lo suficientemente alto como para que todas las distribuciones de frecuencia se consideraran normales, se comprobó esta posibilidad comparando cada una de las distribuciones, con media y desviación típica conocidas [F0(x)], con una distribución normal de igual media y desviación típica [Fn(x)]. Ambas distribuciones se compararon mediante el test de Kolmogorov-Smirnov (Steel, Torrie 1985), empleando las siguientes hipótesis: H₀: F₀(x) = F_n(x)
H₁: F₀(x) ≠ F_n(x)
Posteriormente, se estudiaron las propiedades estadísticas descriptivas de todas las distribuciones para encontrar el mejor estimador no sesgado: normalidad de la distribución (prueba del chi-cuadrado), asimetría (coeficiente de momento de asimetría, a₃), curtosis (coeficiente momento de curtosis, a₄), media (x), desviación estándar (s) y variable normal tipificada (z). No se ha empleado el coeficiente de variación para comparar distribuciones porque pierde su utilidad para medias próximas a cero (Spiegel 1997a). Las expresiones usadas para los coeficientes de asimetría y curtosis son

mientras que, para la variable normal tipificada se empleó la expresión

Considerando que la muestra usada fue N = 30, su distribución puede ser considerada como normal o casi normal (Spiegel 1997b), por lo que se ha empleado la distribución normal para la comparación entre distribuciones.El test empleado para el contraste de hipótesis, en el caso del coeficiente de correlación lineal (r), ha sido el estadístico (Spiegel 1997c)

que tiene distribución de Student con N-2 grados de libertad. En este caso, las hipótesis empleadas fueron H₀: ρ = 0
H₁: ρ ≠ 0
donde ρ es el coeficiente de correlación teórico de la población.Para el análisis de la reproducibilidad de los datos, se ha introducido una variable (denominada por J, por jiggle) que pretende traducir la estabilidad en el tiempo de distribuciones de frecuencias consecutivas (f_i); es una medida de cómo varían de un tren al siguiente las distribuciones, y tiene la siguiente expresión

De este modo puede obtenerse un valor numérico que cuantifica la variación de la distribución de la variable estudiada en las tres rondas consideradas. En caso de que las distribuciones de frecuencia no se modifiquen en absoluto, es decir, sean f_i(x) = f_j(x) para todos los i,j = 1, 2,...n, el valor de J será 0; mientras que cuanto mayor sea el valor de J, mayor será la diferencia entre las distribuciones consideradas.Los datos se muestran como media ± desviación estándar (DE), a menos que se indique otra cosa. El nivel de significación se tomó como p < 0.05.Resultados
Estadística descriptiva de la muestra
Se estudiaron 30 voluntarios, 13 hombres y 17 mujeres. Las medias y desviaciones estándar fueron 44.4 ± 15.7 y 45.8 ± 17.6 años para hombres y mujeres (rangos 25-72 y 23–72, respectivamente). No existe diferencia estadísticamente significativa entre ambos grupos (p = 0.825 para el test t de Student), con distribuciones que se ajustaron bien a la normalidad (p = 0.341 y p = 0.054 respectivamente).Ajuste de los datos de EBF a una función lineal
La amplitud de PAMC durante el test ENR en personas sin patología no es completamente estable. Hay una ligera variación entre V₂ y V₃ con respecto a V₁. Este efecto es debido a una disminución en la reserva de acetilcolina (ACh) hasta que se movilicen las vesículas del depósito de reserva (Desmedt 1973; Hubbard 1974; Dumitru 1995; Kandel, Siegelbaum 2000). Por consiguiente, como primer paso antes de evaluar la posibilidad de ajuste de la sucesión temporal de PAMC a una recta de regresión, debía comprobarse la desviación de linealidad debido a este efecto. Los datos de cada paciente y para cada frecuencia, se ajustaron a una función lineal cuyos parámetros (m y b) se obtuvieron de los resultados reales. Posteriormente, se comparó la diferencia entre los datos reales y otros teóricos, obtenidos a partir de una sucesión perfectamente ajustada a una línea recta. En la figura 1 se muestran las diferencias entre los datos reales y teóricos para voltaje (1A) y área (1B). Las desviaciones hacia arriba en la figura indican, de hecho, disminución en los valores de área y voltaje, ya que la figura muestra la diferencia entre los valores teóricos y los reales.

Figura 1. Diferencias entre datos reales y teóricos obtenidos de las regresiones lineales para las sucesiones de PAMC en las que se midió (A) el voltaje y (B) el área. Los recuadros representan los mismos datos como media ± DE. Las líneas horizontales discontinuas muestran la incertidumbre metodológica. Obsérvese como las escalas de los ejes verticales son diferentes (* p < 0.05 para ANOVA).

Los recuadros representan los datos como media ± DE para todos los datos considerados en conjunto. Las líneas horizontales discontinuas representan los valores límites para incertidumbre metodológica (errores absolutos, ver Material y métodos).Puede observarse en figura 1A que sólo para V2, cuando se mide el voltaje, hay una diferencia estadísticamente significativa entre los datos reales y teóricos. El resto de los datos mostró buen ajuste a una línea recta.Cuando la medida considerada fue el área, los datos reales se ajustaron bien a una función lineal.Comparación entre sexos
Se representaron las medidas de V₄/V₁ y la pendiente de las sucesiones, tanto para el área como para el voltaje, como función de la edad, para ambos sexos. Para ello, se realizó una regresión lineal para de los parámetros estudiados. En caso de existir diferencia entre ambos sexos, se observarían algunas diferencias para la regresión lineal y la edad. Sin embargo, no se encontró ninguna diferencia para ninguna frecuencia de estimulación empleada o ningún parámetro estudiado.

Figura 2. Comparación entre sexos para (A) V₄/V₁ (a) (-0.03/-0.013), (B) el m(a) , (0.006/0.008) (C) V₄/V₁ (V) (8x10^-4/-0.002) y (D ) el m(V) (8x10^-4/-0.002) como función de la edad, durante el tercer tren a 3 Hz. Los números entre paréntesis indican los valores de las pendientes de las rectas de regresión para el hombre y mujer respectivamente. Los círculos vacíos representan a los hombres y cuadrados en negrita representan a las mujeres. Las rectas de regresión se muestran por una línea continua para los hombres y discontinua para las mujeres.

En la figura 2, se muestra V₄/V₁(V), V₄/V₁(a), m(V) y m(a) como función de la edad para el tercer tren de potenciales a 3 Hz. Puede observarse cómo las regresiones lineales para varones y mujeres de todas las medidas realizadas prácticamente se superponen. En la tabla I se muestra el valor de las pendientes de las rectas de regresión como función de la edad para el resto de frecuencias (10, 15 y 20 Hz). No se observó ninguna diferencia en función del sexo entre dos pares de rectas de regresión.

En caso de existir alguna correlación entre los parámetros medidos y la edad de los pacientes, esperaríamos encontrar valores elevados en el coeficiente de correlación. En la tabla II se muestran los valores de los coeficientes de la correlación para los parámetros V₄/V₁(a), V₄/V₁(V), m(a) y m(V) y para todas las frecuencias estudiadas.

Puede verse que, en el caso de los hombres, se encontró una significatividad moderada en caso de V₄/V₁(a) durante el segundo tren a 3 Hz, y en la medida de m(a) durante el segundo tren a 3 Hz. Para las mujeres, la correlación resultó moderadamente significativa en las medidas de V₄/V₁(a) a 3 Hz y m(a) a 10 Hz, mientras la medición de m(V) a 3 Hz resultó altamente significativa.Reproducibilidad de los resultados a EBF
Para estudiar la estabilidad de los resultados EBF, se aplicaron tres trenes de estímulos a 3 Hz. Se ajustaron los datos a funciones gaussianas por el método de los mínimos cuadrados (figura 3) para la pendiente (figuras 3A y 3C) y las razones V₄/V₁ (figuras 3B y 3D), tanto para el voltaje como para el área. A cada distribución se le aplicó el test de Kolmogorov-Smirnov. Todas ellas resultaron ser normales.Para cuantificar la estabilidad de cada serie de rondas de estimulación se empleó el parámetro J (ver Material y métodos) de la serie de tres distribuciones de frecuencia para cada una de las variables estudiadas. Los valores obtenidos para las medidas de voltaje fueron 1.781 y 27.759 para m(V) y V₄/V₁(V), respectivamente (figuras 3A y 3B); mientras que para las medidas de área, los valores obtenidos fueron 0.939 y 7.389 para m(a) y V₄/V₁(a) (figuras 3C y 3D).Resulta evidente que las medidas más estables son las que determinan la pendiente, y que, dentro de éstas, la más estable es la que utiliza el área como variable independiente [m(a)]. Por el contrario, la medida con menor estabilidad es la determinación de V₄/V₁(V).

Figura 3. Funciones de distribución de frecuencias que muestra el ajuste de los datos a funciones gaussianas por el método de mínimos cuadrados para los 3 trenes de estimulación a 3 Hz. (A) m(V), (B) V₄/V₁ (V) , (C) m(a) y (D) V₄/V₁ (a) . Los recuadros en la esquina superior derecha de cada una de las figuras representa la función sumatoria (para los subíndices i,j = 1 hasta 3) del valor absoluto de la diferencia f_i(x) –f_j(x), que está directamente relacionada con la estabilidad del test. Esta función será mayor cuanto más diferencia exista entre las distribuciones de frecuencia. De hecho, la medición del área de cada una de estas funciones corresponden al valor obtenido del parámetro J.

Parámetros característicos de las distribuciones de frecuencia
El paso siguiente, tras haber estudiado las dependencias del sexo y edad, así como la reproducibilidad de cada una de las medidas empleadas, era estudiar las características de sesgo y curtosis de cada una de las distribuciones de frecuencia obtenidas que, como ya se ha visto, se ajustaban a distribuciones normales. En efecto, aunque todas las funciones tenían la forma de campana gaussiana, sin embargo pueden ser más o menos puntiagudas (curtosis) o tener leves asimetrías en sus colas (sesgo). Por tanto, serán más ajustadas a una distribución normal aquellas distribuciones que se acerquen más a los valores de cero (a₃ = 0) para el sesgo y tres (a₄ = 3) para la curtosis, que son los valores de la función de Gauss. En las tablas IIIa y IIIb se muestran los resultados obtenidos.

Por tanto, la variable con valores más próximos a una distribución normal es la m(V) a todas las frecuencias, tanto para el sesgo como para la curtosis, excepto para la frecuencia a 20 Hz, en que la medida que más se ajusta a la normalidad es la V₄/V₁(a), aunque muy próxima a m(V) .Respuesta en función de la frecuencia de estimulación
Por último, se ha estudiado la estabilidad del test ante las distintas frecuencias de estimulación. Se trataba de estudiar cómo se comportaba, en un mismo paciente, la respuesta, para los distintos parámetros estudiados, ante las diferentes frecuencias empleadas.Los resultados se muestran en la tabla IV.

Puede observarse, a partir de los valores mostrados en la tabla IV, que por lo que respecta a V₄/V₁(V) concuerdan muy bien con los referidos por otros autores (Bothelo et al 1952; Lambert et al 1961; Stälberg 1980).La relación entre los valores límite absolutos, considerados como tres veces la desviación estándar, pueden representarse en función de la frecuencia de estimulación. Dado que las magnitudes absolutas, para cada parámetro estudiado, son claramente diferentes, con el objeto de comparar las tendencias han sido normalizadas todas ellas al valor obtenido a 3 Hz. En la figura 4A pueden verse los resultados de este análisis.

Figura 4. Propiedades de los límites de normalidad para las variables estudiadas. (A) Gráfico que representa los rangos de valores límites para las diferentes frecuencias estudiadas. Los coeficientes de correlación respectivos son 0.9595, 0.9979, 0.9779 y 0.9609. (B)Gráfico que muestra la simetría de los límites de normalidad para las distintas frecuencias. En ambos gráficos, los círculos blancos representan m(V), los negros V₄/V₁(V) , los triángulos blancos indican m(a), mientras que los blancos son V₄/V₁(a).

Puede observarse que los coeficientes de correlación para todas las medidas están muy próximos a 1, lo que indica que la variación en los valores de normalidad aumenta de manera lineal con la frecuencia de estimulación, al menos hasta los 20 Hz.Un parámetro interesante de las funciones que definen los límites de normalidad, obtenidos a partir de las medias y desviaciones estándar para cada una de las frecuencias estudiadas, es la simetría que guardan. En la figura 4B se muestran los valores absolutos de los cocientes entre los límites superior e inferior. Puede observarse cómo las distribuciones que corresponden a las mediciones de voltaje, tanto la pendiente como la razón V₄/V₁, son más simétricas que las distribuciones correspondientes a las mediciones de área. Además, dentro de las mediciones de voltaje, la más simétrica es la de la pendiente, que prácticamente está en torno a la unidad para todas las frecuencias estudiadas, mientras que la distribución para V₄/V₁(V) se aparta de la simetría para frecuencias elevadas.Discusión
El test ENR es una exploración neurofisiológica de utilización habitual para el estudio de la fisiología y fisiopatología de la transmisión neuromuscular, como la MG o SMEL, aunque, también puede utilizarse en canalopatías musculares como la miotonía congénita (Scaioli, Morandi 2002; Colding Jorgensen y cols 2003) o, incluso, en la esclerosis lateral amiotrófica, según se ha propuesto (Wang et al 2001).El enfoque realizado en este trabajo, fundamentalmente metodológico, permite abordar, aun cuando sea sólo parcialmente, aspectos diversos de la fisiología y fisiopatología de la transmisión neuromuscular. En este sentido, se han estudiado algunas propiedades fisiológicas, especialmente relacionadas con la edad o el sexo, así como las propiedades estadísticas del ENR para las medidas de área del PAMC y su amplitud. También se han estudiado las propiedades estadísticas de una nueva variable que podría ser de utilidad en el estudio de la transmisión neuromuscular, como es la pendiente de la sucesión temporal de PAMC.Ajuste de los datos de EBF a una función lineal
En personas sanas, el test ENR da lugar a una mínima variación en los PAMC consecutivos, tanto en mediciones de voltaje como del área. En el caso de las medidas de voltaje, la amplitud de V₂ decae con respecto a V₁ de manera significativa, aunque, ya a partir de V₃ y hasta V₁₀, la amplitud vuelve a valores que no difieren significativamente de V₁.Para las medidas de área, se ha observado que ninguna de las áreas de los PAMC difiere significativamente del área del primer potencial, aunque exista discreta disminución de las áreas en los potenciales 3 a 7.Estos datos indican, por un lado, que las medidas de área se ajustarán mejor a una función lineal y, por otro lado, que sobre ellas repercute menos el efecto fisiológico de la movilización del depósito de reserva de ACh. Sin embargo, la desviación transitoria de la amplitud de V₂ no es suficiente como para impedir que las medidas de voltaje en personas sanas puedan ajustarse a funciones lineales con un grado razonable de exactitud.Por tanto, es posible ajustar las sucesiones de potenciales y medidas de área a funciones lineales. Esta característica abre la puerta a la posibilidad de utilizar el comportamiento de la tendencia global de los potenciales, más que la medida puntual de dos de ellos, como variable para el estudio de la transmisión neuromuscular.Comparación entre sexos
El test ENR no varía ni con el sexo ni con la edad, al menos en el rango considerado. Esto significa que la transmisión neuromuscular es una función muy estable y con alto factor de seguridad (Katz 1966; Kandel, Siegelbaum 2000). Este extraordinaria estabilidad funcional contrasta con la variabilidad de otras funciones fisiológicas, como pueden ser la velocidad de conducción, o la amplitud de los potenciales de unidad motora, que se modifican de manera muy significativa con la edad y el sexo (Gregersen 1967; Kemble 1967; Buchthal 1975; Lang et al 1977; Ludin 1995).En la tabla II se muestran 2 mediciones en hombres y 3 en mujeres en las que existe correlación estadísticamente significativa. Sin embargo, son correlaciones obviamente bajas y que no siguen un patrón definido, ni en cuanto al tipo de variable medida (voltaje o área), ni en cuanto a la frecuencia, ni en cuanto al sexo. Como una buena aproximación, puede considerarse, por tanto, que el test ENR no depende del sexo ni de la edad para ninguna de las frecuencias ni de las medidas estudiadas.Reproducibilidad de los resultados
Una de las características más importantes de un test neurofisiológico es que sea reproducible y estable, de modo que sus valores no varíen cuando las condiciones de aplicación son similares.La medida de estabilidad (parámetro J), en realidad, compara el cambio en las distribuciones de frecuencia durante las tres rondas a 3 Hz. A partir de estos valores, resulta evidente que la medida más estable y, por tanto, más reproducible es la pendiente de la sucesión de medidas del área [m(a)], mientras que la menos estable es la medida de la razón V₄/V₁(V). Resulta significativo este hallazgo, ya que es precisamente esta última la medida más empleada en la práctica habitual de la neurofisiología. Considerando por un lado las medidas de pendiente [m(a) y m(V)] y por otro las medidas puntuales [V₄/V₁(a) y V₄/V₁(V)], resulta evidente que las primeras son más estables que las segundas. Esto es lógico pues, aun cuando se ponga gran cuidado en la realización de la prueba, la incertidumbre en una medida puntual siempre será mayor que en una medida de intervalo, como puede ser considerada la medida de pendiente.Características de normalidad de las distribuciones de frecuencia
En general, todas las distribuciones de frecuencia obtenidas, tanto para las medidas de pendiente como para las medidas puntuales, son aceptablemente normales. Este resultado era de esperar, dado el número y la población de donde se han obtenido las muestras.Sin embargo, de todas las medidas realizadas, la que mejor se ajusta a una distribución normal es la pendiente de voltaje, m(V). En este caso, la similitud con la curva gaussiana es muy significativa para todas las frecuencias. La segunda medida cuya distribución de frecuencias es más parecida a la normal es V₄/V₁(a).Para altas frecuencias, a pesar de que las distribuciones siguen ajustándose bien a funciones normales, presentan discretos sesgos hacia la izquierda, en especial, la medida de m(a). Respuesta en función de la frecuencia de estimulación
El análisis de la respuesta, en función de la frecuencia de estímulo, indica que la respuesta fisiológica es lineal, al menos hasta una frecuencia de estimulación de 20 Hz. Sería de esperar que las medidas de voltaje [V₄/V₁(V) y m(V)] se separaran de la linealidad para frecuencias superiores a 10 Hz, en virtud del fenómeno de pseudofacilitación (Dumitru 1995; Ludin 1995). Sin embargo, da la impresión de que este fenómeno no es suficiente para hacer que los valores límites de normalidad se separen de la linealidad, hasta el punto de ser las medidas con límites más simétricos. Este resultado resulta sorprendente dado que, en la práctica clínica, con gran frecuencia se atribuyen a la pseudofacilitación alteraciones en la amplitud de los potenciales obtenidos.Por otro lado, resulta significativo que, precisamente, las medidas puntales de área y voltaje tengan comportamiento normalizado prácticamente similar (figura 4). Además, y aunque para todas las medidas los coeficientes de regresión resultan muy elevados (mayores de 0.95), son las medidas puntuales las que tienen un mejor ajuste.Conclusiones
A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo, podemos enunciar las siguientes conclusiones:

La transmisión neuromuscular es una función extraordinariamente estable a lo largo del rango de edad estudiado (entre 20 y 70 años), no observándose tampoco diferencias significativas con respecto al sexo.
A pesar de que la medición de V₄/V₁(V) sea la determinación más empleada en los laboratorios de neurofisiología (AAEM 2001a; Pavesi et al 2001; Colding-Jorgensen et al 2003), sus propiedades estadísticas son las peores de las cuatro medidas estudiadas. En este sentido, resulta más indicado, tanto desde el punto de vista fisiológico como estadístico, el empleo de medidas de área [V₄/V₁(a)] que presentan distribuciones normales, muy estables y con un comportamiento aceptablemente reproducible. La determinación de V₄/V₁(V) resulta menos reproducible de un estudio al siguiente, por lo que este hecho debe tenerse en cuenta, especialmente cuando se realicen estudios seriados en el tiempo.
Aunque no se ha establecido aún la utilidad de medidas de tendencias, como las propuestas en este trabajo para estudiar la transmisión neuromuscular, deben ser consideradas como candidatos potencialmente útiles. Se ha demostrado que su comportamiento estadístico reúne las mejores propiedades (estabilidad, reproducibilidad, normalidad). También se ha demostrado que la sucesión de PAMC no se separa de la linealidad en condiciones fisiológicas. Es obvio que los trastornos de la unión neuromuscular sí se apartarán del comportamiento lineal. Por ello, dado que el margen de normalidad para las pendientes tanto de voltaje como de área ha quedado establecido en este trabajo, sería relativamente fácil determinar si la respuesta de un músculo a la estimulación se aparta o no del comportamiento lineal previsto. Esta posibilidad, sin embargo, precisará de nuevos estudios en el futuro.

Abreviaturas
AAEM: American Association of Electrodiagnostic Medicine. AchR-ab: anticuerpo anti-receptor de acetilcolina (ACh). EAF: estimulación de alta frecuencia. EBF: estimulaciñon de baja frecuencia. EMGFU: electromiografía (EMG) de fibra única. MG: miastenia gravis. PAMC: potencial de acción muscular compuesto. SMEL: síndrome miasteniforme de Eaton-Lambert. TNM: transmisión neuromuscular.