DISEÑO DE PLATAFORMAS PAR LA EVOLUCION DIRIGIDA DE LA LACASA DE <I>PYCNOPORUS CINNABARINUS</I>

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Madrid, España (especial para SIIC)

Las lacasas de alto potencial redox producidas por los hongos de podredumbre blanca (involucrados en la degradación de la lignina de las paredes celulares vegetales) son unas enzimas con una gran versatilidad biotecnológica y muy pocos requerimientos. Únicamente necesitan oxígeno del aíre para trabajar, oxidan docenas de compuestos de una manera rápida y eficaz y liberan agua como único subproducto. Por este motivo, las lacasas ligninolíticas se consideran como los biocatalizadores verdes ideales del siglo XXI. Sin embargo, su implantación en procesos biotecnológicos se ve dificultada por la carencia de hospedadores apropiados para su producción funcional y diseño genético mediante estrategias de evolución dirigida. En este proyecto se ha llevado a cabo la puesta a punto de una plataforma evolutiva para el diseño de lacasas de alto potencial redox mediante evolución dirigida. Las lacasas de los basidiomicetos ligninolíticos PM1 y de Pycnoporus cinnabarinus han sido sometidas en conjunto a más de 14 ciclos de evolución en combinación con aproximaciones semirracionales para conseguir una colección de mutantes activos, solubles y estables, con elevados niveles de secreción en Saccharomyces cerevisiae. Estas nuevas lacasas mutantes pueden ser un punto de partida idóneo para su diseño hacia aplicaciones biotecnológicas diversas que cubren desde procesos de biorremediación hasta el diseño de bionanodispositivos tridimensionales para microimplantes en seres humanos.

En primer lugar, con el fin de incrementar los niveles de expresión funcional, los correspondientes péptidos señales nativos fueron reemplazados por la secuencia prepro-líder del factor alfa de S. cerevisiae, y los genes de fusión sometidos a evolución conjunta. De esta manera se potenció el efecto beneficioso de la acumulación de mutaciones tanto en la secuencia líder como en la proteína madura, produciendo una sinergia que supuso mejoras en el intervalo de 8 000 a 36 000 veces, dependiendo del gen de fusión en cuestión. Esta exitosa aproximación supone que evolucionar un gen de fusión completo facilita el ajuste de la cadena polipeptídica de las lacasas a las sutilezas de la maquinaria secretora de S. cerevisiae. Entre las herramientas para la generación de diversidad se alternaron métodos convencionales de mutagénesis aleatoria con procesos de recombinación in vivo o in vitro (in vivo DNA shuffling, IvAM). En particular, el diseño de secuencias solapantes de en torno a 50 pb por inserto permitió el ensamblaje de las librerías de mutantes, su barajado y clonado in vivo en un sencillo paso a través de métodos como el IVOE (in vivo overlap extension). Para este fin, se hizo uso de la elevada frecuencia de recombinación homóloga de la levadura que permitió el empleo de su maquinaria eucariótica para la generación de diversidad genética. Es importante enfatizar este punto, puesto que el empleo de S. cerevisiae como hospedador heterólogo en evolución molecular dirigida y biología sintética ha entrado en una nueva dimensión donde el diseño de operones artificiales o rutas metabólicas completas pueden ser fácilmente abordados. En nuestro trabajo se seleccionaron mutaciones de cada proyecto evolutivo y se intercambiaron de un molde proteico a otro en un intento por globalizar determinadas posiciones beneficiosas en ambas lacasas, en virtud de su elevado grado de identidad de secuencia (superior al 75%). Actualmente, hemos dado un paso más en esta aproximación a través de la construcción de lacasas mediante quimeragénesis, haciendo uso de protocolos de recombinación de DNA in vivo e in vitro (resultados enviados a publicar). Las variantes obtenidas mediante este proceso presentan propiedades añadidas de estabilidad y/o perfiles de actividad optimizados frente al pH. Por otro lado, se localizaron mutaciones en la secuencia preprolíder del factor alfa que funcionan con ambas lacasas. En particular se insertaron mutaciones hidrofílicas en el core hidrofóbico del prelíder, lo que indica la posibilidad de evolucionar hacia péptidos señales universales para la secreción heteróloga de lacasas en levaduras. En suma, se han diseñado un conjunto de lacasas altamente estables, activas y solubles, con eficiencias catalíticas mejoradas frente a mediadores naturales y sintéticos, que suponen una referencia y un punto de partida para nuevos estudios de biología sintética.

Bibliografía del artículo
1. González-Pérez D, García-Ruiz E, Alcalde M. Saccharomyces cerevisiae in directed evolution: an efficient tool to improve enzymes. Bioengineering Bugs 3:1-6, 2012.
2. Camarero S, Pardo I, Cañas AI, Molina P, Record E, Martínez AT, Martínez MJ, Alcalde M. Engineering platforms for directed evolution of laccase from Pycnoporus cinnabarinus. Applied & Environmental Microbiology 78:1370-1384, 2012.
3. García-Ruiz E, González-Pérez D, Ruiz-Dueñas FJ, Martínez AT, Alcalde M. Directed evolution of a temperature, peroxide and alkaline pH tolerant versatile peroxidase. Biochemical Journal 441:487-498, 2012.
4. Alcalde M. Fundamentos de evolución molecular dirigida de enzimas. In: Monografías de la Real Academia Nacional de Farmacia. Sánchez-Montero JM ed. En prensa.
5. De Abreu MA, Alvaro-Benito M, Plou FJ, Fernández-Lobato M, Alcalde M. Screening -fructofuranosidases mutant libraries to enhance the transglycosylation rates of β-(26) fructooligosaccharides. Combinatorial Chemistry & High-Throughput Screening 14:730-738, 2011.
6. Mate D, García-Ruiz E, Camarero S, Alcalde M. Directed evolution of fungal laccases. Current Genomics 12:113-122, 2011.
7. Mate D, García-Burgos C, García E, Ballesteros A, Camarero S, Alcalde M. Laboratory evolution of high redox potential laccases. Chemistry & Biology 17:1030-1041, 2010. Full paper seleccionado para preview en Chemistry & Biology, Ref: Sayut DJ, Sun L. Creating designer laccases. Chem Biol 27:918-920, 2010.
8. García E, Maté D, Ballesteros A, Martínez AT, Alcalde M. Evolving thermostability in mutant libraries of ligninolytic oxidoreductases expressed in yeast. Microbial Cell Factories 9:17, 2010.
9. Alcalde M. Mutagenesis protocols in Saccharomyces cerevisiae by in vivo overlap extension. In: In vitro mutagenesis protocols, 3rd ed. Methods in Molecular Biology 634. (Bramman J. ed) Totowa, New Jersey: Springer-Humana Press. 3-15. ISBN: 978-1-60761-651-1.
10. Zumárraga M, Vaz Domínguez C, Camarero S, Shleev S, Polaina J, Martínez-Arias A, Ferrer M, De Lacey A, Fernández V, Ballesteros A, Plou FJ, Alcalde M. Combinatorial saturation mutagenesis of the Myceliophthora thermophila laccase T2 mutant: the connection between the C-terminal plug and the conserved 509VSG511 tripeptide. Combinatorial Chemistry & High-Throughput Screening 11:807-816, 2008.
11. Zumárraga M, Camarero S, Martínez-Arias A, Ballesteros A, Plou FJ, Alcalde M. Altering the laccase functionality by in vivo assembly of mutant libraries with different mutational spectra. Proteins: Structure, Function and Bioinformatics 71:250-260, 2010.
12. Kunamneni A, Camarero S, García C, Plou FJ, Ballesteros A, Alcalde M. Engineering and applications of fungal laccases for organic sinthesis. Microbial Cell Factories 7(32):1-17, 2008.
13. Kunamneni A, Plou FJ, Ballesteros A, Alcalde M. Laccase and their applications: a patent review. Recent Patents on Biotechnology 2:10-24, 2008.
14. Ferrer M, Beloqui A, Zumárraga M, Alcalde M, Golyshin PN. Microbes and enzymes: recent trends and new directions to expand protein space. In: Protein engineering handbook. Eds.: Lutz S, Bornscheuer UT, Wiley-VCH Verlag GMBH & Co; 1 pp. 233-264, 2008.
15. Zumárraga M, Bulter T, Shleev S, Polaina J, Plou FJ, Ballesteros A, Alcalde M. In vitro evolution of a fungal laccase in high concentrations of organic cosolvents. Chemistry & Biology 14:1052-1064, 2007.
16. Cañas AI, Alcalde M, Plou FJ, Martínez MJ, Martínez AT, Camarero S. Transformation of polycyclic aromatic hydrocarbons by laccase is strongly enhanced by phenolic compounds present in soil Environmental Science and Technology 47:2964-2971, 2007.
17. Zumárraga M, Plou FJ, García H, Ballesteros A, Alcalde M. Biorremediation of polycyclic aromatic hydrocarbons by a fungal laccases engineered by directed evolution. Biocatalysis and Biotransformation 25:219-228, 2007.
18. Alcalde M, Ferrer M, Plou FJ. Environmental biocatalysis: from remediation with enzymes to novel green processes. Biocatalysis and Biotransformation 25:113, 2007.
19. Kunamneni A, Ballesteros A, Plou FJ, Alcalde M. Fungal laccase: a versatile enzyme for biotechnological applications. In: Communicating current research and educational topics and trends in applied microbiology. Ed: Méndez-Vilas. Microbiology Book Series, Formatex Publishers, Spain: 233-245, 2007.
20. Alcalde M. Laccase: biological functions, molecular structure and industrial applications. In: Industrial enzymes: structure, function and applications. Eds: Polaina J, MacCabe AP. Springer, New York, pp. 459-474, 2007.
21. Alcalde M, Zumárraga M, Polaina J, Ballesteros A, Plou FJ. Combinatorial saturation mutagenesis by in vivo overlap extension for the engineering of fungal laccases. Combinatorial Chemistry and High-Throughput Screening 9:719-727, 2006.
22. Alcalde M, Ferrer M, Plou FJ, Ballesteros A. Environmental biocatalysis: from remediation with enzymes to novel green processes. Trends in Biotechnology 24:281-287, 2006.
23. Beloqui A, Pita M, Polaina J, Martínez A, Golyshina O, Zumárraga M, Yakimov M, García H, Alcalde M, Fernández V, Elborough K, Andreu J, Ballesteros A, Plou FJ, Timmis K, Ferrer M, Golyshin P. Novel polyphenol oxidase mined from a metagenome expression library of bovine rumen. The Journal of Biological Chemistry 281:22933-22942, 2006.
24. Mencía M, Martínez A, Alcalde M, De Lorenzo V. Identification of a -hexachlorocyclohexane dehydrochlorinase (LinA) variant with improved expression and solubility properties. Biocatalysis and Biotransformation 24:223-230, 2006.
25. Reyes-Duarte D, Polaina J, López-Cortés N, Alcalde M, Plou FJ, Elborough K, Ballesteros A, Timmis KN, Golyshin PN, Ferrer M. Conversion of a carboxylesterase into a triacylglycerol lipase by random mutation. Angewandte Chemie-International Edition 44:7553-7557, 2005.
26. Alcalde M, Bulter T, Zumárraga M, García H, Mencía M, Plou FJ, Ballesteros A. Screening mutant libraries of fungal laccases in the presence of organic solvents. Journal of Biomolecular Screening 10:624-631, 2005.
27. García-Arellano H, Alcalde M, Ballesteros A. Use and improvement of microbial redox enzymes for environmental purposes. Microbial Cell Factories 3:10-13, 2004.
28. Alcalde M, Farinas ET, Arnold FH. Colorimetric high-throughput assay for alkene epoxidation catalyzed by cytochrome P450 BM-3 variant 139-3. Journal of Biomolecular Screening 9:141-146, 2004.
29. Farinas ET, Alcalde M, Arnold FH. Alkene epoxidation catalysed by cytochrome P450 BM-3 mutant 139-3. Tetrahedron 60:525-528, 2004.
30. Bulter T, Alcalde M, Sieber V, Meinhold P, Schlachtbauer C, Arnold FH. Functional expression of a fungal laccase in Saccharomyces cerevisiae by directed evolution. Applied Environmental Microbiology 69:987-995, 2003.
31. Bulter T, Alcalde M. Preparing libraries in Saccharomyces cerevisiae. In: Directed evolution library creation. Methods and protocols. Methods in molecular biology Vol. 231. Eds: Arnold FH, Gergiou G. Humana Press, Totowa, New Jersey: 17-22, 2003.
32. Bulter T, Sieber V, Alcalde M. Screening mutant libraries in Saccharomyces cerevisiae. In: Directed enzyme evolution. Screening and selection methods. Methods in molecular biology Vol. 230. Eds: Arnold FH, Gergiou G. Humana Press, Totowa, New Jersey, pp. 99-108, 2003.
33. Alcalde M, Bulter T. Colorimetric assays for screening laccases. In: Directed enzyme evolution. Screening and selection methods. Methods in molecular biology Vol. 230. Eds: Arnold FH, Gergiou G. Humana Press, Totowa, New Jersey, pp. 193-202, 2003.
34. Alcalde M. Evolución molecular dirigida. Investigación y Ciencia. (Versión española de Scientific American) 326:69-77, 2003.
35. Alcalde M, Bulter T, Arnold FH. Colorimetric assays for biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by fungal laccases. Journal of Biomolecular Screening 7:537-543, 2002.
36. Sun L, Bulter T, Alcalde M, Petronia I, Arnold FH. Modification of galactose oxidase to introduce glucose 6-oxidase activity. ChemBioChem 8:781-783, 2002.