LA INSERCIÓN EN LA MEMBRANA MODIFICA LAS PROPIEDADES DE LA PROTEÍNA CONJUGATIVA TRWB AUMENTANDO LA AFINIDAD Y LA ESPECIFICIDAD POR ATP

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La conjugación bacteriana es un proceso por el cual una bacteria es capaz de transferir una molécula de DNA debidamente procesada (relaxosoma) a una bacteria receptora mediante un ensamblaje proteico denominado sistema de secreción tipo 4 (T4SS) que establece el contacto físico entre ambas (1). Todos los sistemas conjugativos bacterianos codifican una proteína de membrana imprescindible para el proceso que conecta el relaxosoma con el T4SS. Estas proteínas constituyen la familia de proteínas acopladoras (T4CP). En particular, TrwB es la proteína acopladora del plásmido conjugativo R388 (2). Su secuencia además de dos hélices transmembrana en el extremo amino terminal, posee dos motivos de unión a nucléotidos (Walker A y Walker B) que se encuentran también presentes en ATPasas (3, 4). Estudios al respecto indican que posiblemente la función biológica de este tipo de proteínas sea doble, por una parte conectan el relaxosoma al sistema de transporte. Pero también se cree que podrían actuar como motores moleculares que, utilizando la energía liberada en la hidrólisis de ATP, bombearían el DNA desde la bacteria donadora a la receptora. No obstante, hasta el momento no se ha descrito actividad ATPasa en ninguna de las proteínas acopladoras purificadas en detergente (5). Únicamente un mutante soluble de TrwB, TrwBΔN70, que carece de las hélices transmembrana muestra actividad ATPasa dependiente de DNA (6). Estos resultados contradictorios entre la proteína salvaje purificada en detergentes y el mutante soluble TrwBΔN70 ya han sido observados en otros trabajos anteriores de nuestro grupo por ejemplo en la mayor estabilidad de la proteína salvaje frente a la temperatura y los agentes caotrópicos (7) y en la oligomerización en vivo que únicamente se produce en la proteína salvaje (4). Todos estos resultados sugieren que la actividad ATPasa pudiera estar inhibida por la presencia del detergente o porque el domino transmembrana actúa como regulador de la actividad. Con esa idea en mente se procedió a reconstituir TrwB purificada en la bicapa lipídica con el doble propósito de eliminar el detergente y de devolver la proteína a un entorno que simula el natural. Dada la dificultad de manejo de las proteínas de membrana, aunque existen diferentes métodos de reconstitución y numerosas publicaciones al respecto, se procedió a la puesta a punto del método de reconstitución mediada por detergentes para TrwB. El método se basa en eliminar el detergente de una mezcla de liposomas parcialmente solubilizados y proteína purificada en detergente utilizando partículas de poliestireno lo que favorece la inserción de la proteína en la membrana. En el caso de TrwB se adecuaron las condiciones de detergente necesarias para solubilizar los liposomas (octil glucósido 19 mM/2,5 mM lípido) y la cantidad de partículas de poliestireno utilizadas, la temperatura de incubación (57.1 mg de partículas/mg de detergente durante 16 h a 4 ºC). A continuación se separaron los proteoliposomas (proteína insertada en la membrana de los liposomas) de los liposomas y de la proteína agregada mediante un gradiente de sacarosa. Una vez separados los liposomas se estudió la orientación de la proteína para lo que se emplearon dos métodos. Por una parte mediante citometría de flujo y anticuerpos fluorescentes contra las colas de histidina que TrwB tiene en el extremo carboxilo se determinó que la proteína se encontraba insertada en los liposomas y previsiblemente en una orientación homogénea hacia el exterior. Por otra parte, utilizando una combinación de reactivos de tiol permeables e impermeables a la membrana se determinó que la orientación de TrwB estaba insertada uniformente en los liposomas con el dominio citosólico hacia el exterior.
Una vez comprobada la orientación uniforme de los liposomas se procedió a estudiar el comportamiento de TrwB ante la unión a nucleótidos. En este punto es necesario mencionar que trabajos anteriores de nuestro grupo describen un comportamiento totalmente diferente entre el mutante soluble y TrwB purificada en presencia de detergentes. Mientras el primero une con gran afinidad indistintamente todos los nucleótidos estudiados, TrwB purificada en detergente une preferentemente nucleótidos púricos trifosfato (ATP, GTP) pero en cualquier caso con menor afinidad (8). Con estos antecedentes se procedió a estudiar el comportamiento de TrwB insertada en la membrana respecto a la unión a nucléotidos. Los resultados obtenidos indican que en esta situación TrwB une específicamente ATP y con mayor afinidad que TrwBΔN70 (KdATP = 4.8 x10-5 M para proteoliposomas y KdATP = 2.2 x10-4 M para el mutante soluble). A pesar que los proteoliposomas de TrwB no mostraron actividad ATPasa, los resultados sobre unión a nucleótidos obtenidos con proteoliposomas sugieren que en estas condiciones TrwB se acerca al comportamiento que cabría esperar de una ATPasa. Es decir, gran afinidad y alta especificidad por ATP. El hecho de que en estas condiciones no se manifieste la actividad ATPasa puede deberse a que si el dominio transmembrana ejerce un papel regulador sea necesaria la presencia en el sistema de otras proteínas conjugativas de R388 que liberen la regulación negativa que el domino transmembrana de TrwB parece ejercer. Estos resultados abren la puerta a nuevos estudios que ayudarán a esclarecer el modo de actuación de TrwB en la conjugación bacteriana y, por tanto, ayudar a controlar la diseminación de la resistencia antibióticos en bacterias.