AISLAMIENTO DE CÉLULAS CD34+ DÉRMICAS MEDIANTE DISGREGACIÓN Y SEPARACIÓN MAGNÉTICA.

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En la piel sana, el marcador de superficie CD34 se expresa en las células dendríticas, endoteliales y perifoliculares, además de en algunas áreas concretas del folículo piloso, glándulas ecrinas y fascículos nerviosos. Se ha descrito que estas células están implicadas en la maduración y proliferación de las células madres mesenquimales y epiteliales adyacentes y que podrían participar en repuestas inmunes locales y en la síntesis de colágeno. También se ha descrito una posible implicación en la formación de un estroma desmoplásico alrededor de ciertos tumores epiteliales cutáneos. Sin embargo, queda mucho por discernir acerca del papel que juegan las células CD34+ dérmicas en la fisiopatología de la piel, por lo que se hace necesario el desarrollo de un protocolo de aislamiento, con el fin de estudiar la funcionalidad de las mismas.

Para determinar el porcentaje de células CD34+ presentes en la piel, 44 muestras de piel humana fueron disgregadas enzimáticamente y analizadas mediante citometría de flujo. El análisis demostró la presencia de un porcentaje relevante de células CD34+ (14,7 ± 8,4%) que resultaron ser negativas para los marcadores de superficie CD45 y CD31, y por tanto no atribuibles a la presencia de células sanguíneas ni endoteliales, respectivamente.

Con el fin de determinar si la fracción CD34+ presentaba un origen dérmico y/o epidérmico, 3 muestras independientes de piel fueron divididos en 3 fragmentos idénticos y fueron sometidos a tres procesamientos enzimáticos distintos. Un primer procesamiento consistió en el tratamiento con dispasa, permitiendo la separación mecánica de la epidermis y la dermis, que fueron posteriormente tratadas con tripsina de manera independiente, obteniendo las fracciones celulares denominadas “epidermis” y “dermis”, respectivamente. Un segundo procesamiento consistió en el tratamiento con colagenasa, obteniendo la fracción celular denominada “colagenasa”. Finalmente, el tercer tratamieno consistió en la digestión con tripsina, tras lo que se obtuvo la fracción “tripsina”. Cabe destacar que las fracciones “epidermis” (0,15±8,4%) y “tripsina” (1,98±1,37%) presentaron un porcentaje menor de células CD34+ que la fracción “dermis” (5,10±3,48) y “colagenasa” (16,00±4,72), siendo las diferencias entre la fracción colagenasa y el resto de las fracciones estadísticamente significativas. Estos resultados sugirieron que la mayoría de las células CD34+ de la piel tenían un origen dérmico y la digestión con colagenasa era la mejor opción para un óptimo aislamiento de las mismas.
Con el objetivo de caracterizar la población CD34+, pusimos a punto un protocolo basado en la digestión con colagenasa a partir de piel total y en el uso de bolas magnéticas unidas a anticuerpos anti-CD34. Tras poner a punto el protocolo, obtuvimos purezas superiores al 85%, aunque la eficiencia del proceso fue baja, obteniendo únicamente un 5,8±3,3% de células CD34+ con respecto a la población de partida.

A pasar de la baja eficiencia, este protocolo nos permitió obtener una fracción CD34+ de alta pureza y poder así caracterizarla adecuadamente, con respecto a la fracción negativa y a la fracción colagenasa no purificada (“total”). Cuando dichas fracciones fueron cultivadas en un medio y condiciones específicas para el crecimiento de queratinocitos, únicamente las fracciones “total” y “CD34-“ dieron lugar a crecimiento de queratinocitos de manera consistente, mientras que en el caso de la fracción CD34+, únicamente en 1 de 14 cultivos independientes se observaron colonias de queratinocitos. La fracción CD34+ resultó ser positiva para la expresión del marcador vimentina, tanto por citometría de flujo, como por inmunofluorescencia y microscopía confocal, corroborando por tanto su origen dérmico, con una mínima presencia de queratinocitos.

En resumen, hemos desarrollado un protocolo de aislamiento de la población CD34+ presente en la dermis humana, basado en la digestión con colagenasa de biopsias de piel total y subsiguiente purificación con bolas magnéticas con anticuerpos específicos frente al antígeno CD34. Este protocolo permite la obtención de poblaciones celulares CD34+ con una eficiencia relativamente baja (5,8±3,3%; n=16) pero con una pureza superior al 85%. Dado el posible papel de estas células en la fisiología de la piel, la fracción estromal CD34+ de piel humana merece un análisis más detallado y por ello creemos que el protocolo de aislamiento desarrollado por nuestro grupo puede proporcionar una herramienta indispensable para su caracterización fenotípica y funcional.

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