EVALUACION DE LA TROMBOGENICIDAD DE LOS CITOTROFOBLASTOS DE PLACENTAS OBTENIDAS DE MUJERES CON PREECLAMPSIA

Conclusión breve
El agregado de una citoquina inflamatoria (factor de necrosis tumoral alfa) a preparados de citotrofoblastos de placentas de mujeres sanas o con preeclampsia induce mayor grado de activación y expresión del factor tisular en las pacientes con la complicación mencionada, pero el índice de apoptosis es similar en todos los casos, lo cual sugiere que los citotrofoblastos poseen potencial trombogénico intrínseco más elevado en la preeclampsia.

Resumen

Objetivo: El presente estudio se realizó con el fin de investigar si el incremento del efecto trombogénico de las células del citotrofoblasto de las mujeres con preeclampsia puede ser explicado por el aumento de la tasa de apoptosis. Diseño del estudio: Se aislaron células del citotrofoblasto de la placenta de: a) mujeres nulíparas sin hipertensión arterial, con parto de término y b) mujeres nulíparas con preeclampsia. Los citotrofoblastos fueron identificados por la morfología celular y la positividad frente a marcadores para citoqueratina y GnRH. Se agregó a dichas células, in vitro, la citoquina inflamatoria factor de necrosis tumoral alfa (FNT-α) y se las incubó durante 24 horas. Se evaluaron el antígeno del factor tisular, su actividad y el grado de apoptosis, antes y después de la estimulación con FNT-α. Resultados: La estimulación con FNT-α aumentó significativamente la actividad del factor tisular, tanto en los citotrofoblastos de las mujeres con preeclampsia (0.08 ± 0.04 pmol/min/10⁶ células a 0.53 ± 0.19 pmol/min/10⁶ células) como en los de aquellas sin esa complicación (0.07 ± 0.04 pmol/min/10⁶ células a 0.30 ± 0.16 pmol/min/10⁶ células). También se produjo incremento significativo de la cantidad del antígeno de factor tisular en los citotrofoblastos de ambos grupos de participantes (3.6 ± 0.9 fmol/10⁶ células a 34.0 ± 7.5 fmol/10⁶ células, y 7.5 ± 1.4 fmol/10⁶ células a 25.4 ± 2.2 fmol/10⁶ células, respectivamente). La magnitud del incremento del antígeno y de la actividad del factor tisular posterior a la estimulación fue significativamente mayor en los citotrofoblastos de las gestantes con preeclampsia. Por el contrario, la elevación del índice de apoptosis del trofoblasto fue similar (aproximadamente del doble) luego de la inducción con FNT-α, tanto en las mujeres con preeclampsia como en aquellas sin tal complicación. Conclusión: El aumento del antígeno y de la actividad del factor tisular en respuesta a la exposición del citotrofoblasto de mujeres con preeclampsia al FNT-α no puede ser explicado por el incremento de la apoptosis. Los datos presentados sugieren que los citotrofoblastos tienen, en la preeclampsia, mayor potencia trombogénica intrínseca y son más sensibles a la estimulación por el FNT-α.

Palabras clave
citotrofoblastos, actividad procoagulante, apoptosis, citoquinas inflamatorias, preeclampsia

Clasificación en siicsalud

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Especialidades

Principal: Obstetricia y Ginecología,

Relacionadas: Anatomía Patológica, Bioquímica, Diagnóstico por Laboratorio, Hematología, Inmunología, Medicina Reproductiva,

Enviar correspondencia a:
Lisa N. Boggio, Northwestern University, IL 60611, Chicago, EE.UU.

Patrocinio y reconocimiento
El trabajo fue financiado parcialmente por la A. N. and Pearl G. Barnett Family Foundation.

THE THROMBOGENIC EFFECT OF AN INFLAMMATORY CYTOKINE ON TROPHOBLASTS FROM WOMEN WITH PREECLAMPSIA

Abstract
Objective: This study was undertaken to investigate whether the increased thrombogenic potential of cytotrophoblastic cells of women with preeclampsia can be accounted for by increased rates of apoptosis. Study design: Cytotrophoblasts were isolated from the placenta of (a) nulliparous women without hypertensive disease who delivered at term and (b) nulliparous women with preeclampsia. The cytotrophoblasts were identified by morphology, and cytokeratin and GnRH positivity. The inflammatory cytokine TNF-α was added to cytotrophoblasts in vitro and incubated for 24 hours. Tissue factor antigen, activity and amount of apoptosis were evaluated both before and after TNF-α stimulation. Results: TNF-α simulation significantly increased tissue factor activity both in the cytotrophoblasts of women with (0.08 ± 0.04 pmol/min/10⁶ cells to 0.53 ± 0.19 pmol/min/10⁶ cells) and without (0.07 ± 0.04 pmol/min/10⁶ cells to 0.30 ± 0.16 pmol/min/10⁶ cells) preeclampsia. TNF-α stimulation of the cytotrophoblasts also significantly increased tissue factor antigen in the cytotrophoblasts of both groups of women (3.6 ± 0.9 fmol/10⁶ cells to 34.0 ± 7.5 fmol/10⁶ cells, and 7.5 ± 1.4 fmol/10⁶ cells to 25.4 ± 2.2 fmol/10⁶ cells, respectively). For both tissue factor antigen and activity, the magnitude of increase after stimulation was significantly greater in the preeclamptic cytotrophoblasts. In contrast, both normal and preeclamptic cytotrophoblasts showed similar increases in their apoptotic indices (approximately 2-fold) after induction by TNF-α. Conclusion: The greater response of tissue factor activity and antigen to TNF-α by preeclamptic cytotrophoblasts cannot be accounted for by the increase in apoptosis. These data suggest that preeclamptic cytotrophoblasts are inherently more thrombogenic and more sensitive to TNF-α stimulation.

Key words
cytotrophoblasts, procoagulant activity, apoptosis, inflammatory cytokines, preeclampsia

EVALUACION DE LA TROMBOGENICIDAD DE LOS CITOTROFOBLASTOS DE PLACENTAS OBTENIDAS DE MUJERES CON PREECLAMPSIA

(especial para SIIC © Derechos reservados)

Artículo completo
Introducción

Entre las complicaciones del embarazo, la preeclampsia es una de las causas principales de morbilidad y mortalidad materna y perinatal.^1,2 La extracción de la placenta conduce a la resolución de la enfermedad, hallazgo que indica que ciertas alteraciones en la placenta desempeñan un papel importante en la patogenia del trastorno. Estudios histológicos en la placenta de pacientes con preeclampsia también demuestran anormalidades en el endotelio y los citotrofoblastos, que incluyen la alteración de la diferenciación tardía del citotrofoblasto, el fracaso de la invasión de dicho tejido por el endotelio y la notable proliferación del estrato citotrofoblástico. Dichos cambios pueden ser reproducidos en cultivos de citotrofoblastos en condiciones de hipoxia.³

Una cantidad de observaciones revelaron también que las mujeres con preeclampsia tienen una respuesta inflamatoria materno-fetal anormal. Durante los dos primeros trimestres de la gestación, el riesgo de preeclampsia se correlaciona con elevación de los niveles séricos de marcadores inflamatorios, incluidos el factor de necrosis tumoral alfa (FNT-α), el receptor soluble p55 y los receptores 1 y 2 para FNT-α, el receptor para interleuquina 2 (IL-2) y la activación de leucocitos.^4-10 También se halló incremento de marcadores de la activación endotelial, como la molécula de adhesión endotelial 1 y la fibronectina celular ED+,^4,11,12 y activación del sistema de la coagulación en pacientes con preeclampsia,¹³ lo cual apoya la hipótesis de que factores protrombóticos pueden inducir isquemia placentaria e incrementar el riesgo de preeclampsia.¹ Además, se observó aumento de la apoptosis en citotrofoblastos y sincitiotrofoblastos placentarios.^14,15 La combinación de estos hallazgos sugirió la hipótesis de que ciertos cambios inflamatorios durante las etapas iniciales del embarazo activan el sistema de la coagulación y aumentan la muerte celular, de modo que, finalmente, serían responsables de la alteración de la transformación placentaria observada en las mujeres con preeclampsia.

Debido a la posibilidad de que las modificaciones inflamatorias al inicio de la gestación se vinculen con los hallazgos tardíos en la preeclampsia, estudiamos el efecto in vitro del FNT-α sobre citotrofoblastos obtenidos en cultivos primarios de placenta. Formulamos la hipótesis de que los citotrofoblastos placentarios mostrarían aumento de la apoptosis, así como de su potencia procoagulante, en respuesta a una citoquina inflamatoria, de acuerdo con la medición del antígeno y de la actividad del factor tisular (FT).

Materiales y métodos

Se obtuvieron placentas a partir de una población de mujeres con preeclampsia y de otra de control sin dicha complicación. La preeclampsia fue definida como la aparición, después de las 20 semanas de gestación, de presión arterial (PA) sistólica > 140 mm Hg o PA diastólica > 90 mm Hg en dos ocasiones, con un intervalo mínimo de 6 horas entre ellas, junto con proteinuria > 300 mg/24 horas o > 2+ en tiras reactivas para orina. Se excluyeron del estudio las mujeres con enfermedades preexistentes (hipertensión arterial crónica, diabetes mellitus, enfermedad autoinmune o insuficiencia renal), con antecedentes de muerte fetal intrauterina o con gestación menor de 34 semanas en el momento de la presentación del parto o inicio de la preeclampsia.

Las placentas fueron procesadas dentro de las 4 horas posteriores al parto, según una modificación del método de Kliman.^16,17 En forma resumida, se procedió a disecar las placentas de la membrana coriónica, los vasos y los tejidos fibrosos, y a lavarlas minuciosamente con solución salina balanceada de Hank (Hank’s Buffered Salt Solution, HBSS). Se seleccionaron y desmenuzaron aproximadamente 100 g de tejido húmedo, y se realizó digestión con tripsina y desoxirribonucleasa I mediante incubación a 37°C durante 30 minutos. Posteriormente, la mezcla fue filtrada y se agregó suero fetal bovino (fetal calf serum, FCS) al líquido filtrado que contenía una suspensión celular, para finalizar la proteólisis. Dicha suspensión celular fue centrifugada a 1 200 x durante 30 minutos, según un gradiente de Percoll discontinuo. Se apartaron las células de la interfase, se las lavó con HBSS y se las suspendió nuevamente en medio MEM con D-valina de Eagle, el cual contenía 20% de FCS dializado, 1% de glutamina y 50 μg/ml de gentamicina. La suspensión celular obtenida, rica en citotrofoblastos, fue luego preincubada durante 4 horas a 37°C en suero fetal bovino al 10%, junto con 50 μg/ml de gentamicina, y sembrada en 6 pocillos revestidos de membrana extracelular (Matrigel^TM). Se incubaron los preparados en CO₂ al 5%, a 37°C, durante una noche. Los citotrofoblastos fueron identificados en los cultivos de acuerdo con su morfología y con tinciones inmunohistoquímicas para citoqueratina (8.12, clon cr92 para citoqueratina 18), para GnRH (positiva) y para vimentina (negativa). Las células endoteliales se identificaron mediante tinción para CD 31. La presencia de leucocitos contaminantes se reconoció con la tinción para CD 45. Todos los experimentos se realizaron durante el primer pasaje de las células, dentro de los 5 días de su obtención.

Los citotrofoblastos, aproximadamente 2 x 10⁵ células por pocillo, en 6 pocillos, fueron expuestos a una concentración final de 20 ng/ml de FNT-α durante 24 horas, a 37°C, para inducir la apoptosis.¹⁸ Los preparados de control respectivos se incubaron en igual volumen de los medios de cultivo. También se utilizó ligando de Fas para inducir la apoptosis. No se observó ningún efecto inductor de la apoptosis (datos no presentados), hecho que confirmó un informe previo sobre la falta de funcionalidad del Fas expresado por los citotrofoblastos.¹⁹ Por consiguiente, no se utilizó adicionalmente el ligando de Fas en este estudio.

Se realizó tinción de las células con Annexin V y yoduro de propidio, de acuerdo con el protocolo de detección de apoptosis del equipo de reactivos de R&D systems (Mineápolis, EE.UU.).²⁰ La actividad del FT se determinó en las suspensiones celulares según un protocolo modificado de Consonni y col.²¹ La sensibilidad de esta prueba es 0.01 pmol/min/10⁶, y su coeficiente de variación es 48%. La prueba para el antígeno de FT se realizó de acuerdo con el protocolo del equipo IMUBIND de actividad del factor tisular por ELISA, de American Diagnostica (Greenwich, EE.UU.). En esta prueba, el coeficiente de variación de la misma determinación es 4.5% y aquel entre diferentes determinaciones es 7.5%. Su sensibilidad es 20 pg/ml.

Todos los resultados se presentan como el promedio ± la desviación estándar (DE). Las diferencias entre los valores promedio se analizaron mediante la prueba t de Student. Se calculó la magnitud del cambio en la actividad y el antígeno del FT de los citotrofoblastos luego de la estimulación con FNT-α, como el porcentaje del valor previo en la prueba respectiva. Todas las pruebas tuvieron dos colas y se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0.05. El análisis estadístico empleó el programa Minitab 13 (Minitab Inc., State College, EE.UU.).

El Comité de Revisión Institucional de la Northwestern University aprobó el protocolo de este estudio.

Resultados

Se obtuvo la placenta de 9 mujeres con preeclampsia y de otras 9 sin esa complicación. Las características demográficas de las participantes se presentan en la tabla 1. Las placentas se utilizaron para comparar el índice de apoptosis en cada grupo. A partir de estas 18 placentas se seleccionaron 10 en forma aleatoria (5 de cada grupo) para analizar adicionalmente la presencia del antígeno de FT y determinar su actividad.

La actividad del FT de los citotrofoblastos se examinó antes y después de su incubación con FNT-α, en una concentración final de 20 ng/ml durante 24 horas, a 37°C. Se prepararon 6 pocillos con suspensión de citotrofoblastos, con aproximadamente 2 x 10⁵ células por pocillo, a partir de placentas sanas y de otras de pacientes con preeclampsia. La figura 1A muestra la actividad del FT antes y después de la estimulación con FNT-α. Inicialmente, dicha actividad correspondió a 0.07 ± 0.04 pmol/min/10⁶ células en los citotrofoblastos sanos, y a 0.08 ± 0.04 pmol/min/10⁶ en los citotrofoblastos en situación de preeclampsia (p > 0.05). Después de la estimulación con FNT-α, la actividad del FT se incrementó en los citotrofoblastos sanos a 0.30 ± 0.16 pmol/min/10⁶(p < 0.01); por el contrario, en los citotrofoblastos de pacientes con preeclampsia dicha actividad aumentó a 0.53 ± 0.19 pmol/min/10⁶(p < 0.001). En esta última situación los citotrofoblastos mostraron mayor respuesta a la estimulación con FNT-α (614% ± 122% versus 403% ± 151%, p < 0.05).

Figura 1. Actividad (A) y antígenos (B) del FT de citotrofoblastos de placenta de mujeres sanas o con preeclampsia, antes y después de la incubación con FNT-α (20 ng/ml) durante 24 horas.

Por medio de inmunoensayo enzimático (ELISA) se cuantificó también el antígeno del FT, antes y después de la incubación de los citotrofoblastos con FNT-α en una concentración final de 20 ng/ml, durante 24 horas, a 37°C. En la figura 1B se presentan tales resultados. Al inicio del estudio, los citotrofoblastos de mujeres sin hipertensión mostraron una concentración de antígeno del FT de 7.5 ± 1.4 fmol/10⁶ células, en tanto que aquellos provenientes de pacientes con preeclampsia tuvieron una cantidad menor de ese antígeno, de 3.6 ± 0.9 fmol/10⁶ células (p < 0.001). Luego de la estimulación con FNT-α, el antígeno del FT aumentó en los citotrofoblastos sanos a 25.4 ± 2.2 fmol/10⁶ células (p < 0.0001). En los citotrofoblastos de mujeres con preeclampsia, la estimulación también aumentó los niveles de antígeno a 34.0 ± 7.5 fmol/10⁶ células (p < 0.0001), pero la magnitud de la respuesta fue mayor (852% ± 127%) que en los citotrofoblastos sanos (252% ± 76%, p < 0.001).

Antes y después de la incubación celular con FNT-α (como se describió más arriba) se separaron diferentes muestras de citotrofoblastos, que fueron teñidas con Annexin V y yoduro de propidio marcados con FITC. Se cuantificó el porcentaje de citotrofoblastos apoptóticos, y el resultado se presenta en la figura 2. El índice basal de apoptosis en el grupo de placentas sanas fue 5.0% ± 0.5%, mientras que en células de pacientes con preeclampsia fue 5.1% ± 0.4%. No hubo ninguna diferencia significativa entre ambos grupos (p > 0.05). Con posterioridad a la estimulación con FNT-α, los índices de apoptosis fueron 9.6% ± 0.7% y 9.7% ± 0.6%, respectivamente. Esos valores no difirieron entre sí (p > 0.05) y tampoco hubo diferencia estadísticamente significativa alguna en la magnitud de la respuesta apoptótica al FNT-α entre los citotrofoblastos de mujeres sanas o con preeclampsia.

Figura 2. Indice de apoptosis de los citotrofoblastos de placentas de mujeres sanas o con preeclampsia, antes y después de la incubación con FNT-α (20 ng/ml) durante 24 horas.

Discusión

El presente trabajo se basó en un modelo celular²² con el objetivo de estudiar la disfunción de la coagulación de la placenta en situación de preeclampsia, tanto en presencia de estimulación por citoquinas inflamatorias como en su ausencia. Según este modelo, la coagulación es iniciada por el acoplamiento del FT con fosfatidilserina sobre la superficie celular. Los resultados de este estudio revelan que, en condiciones basales, el antígeno del FT no está presente en mayor grado en las pacientes con preeclampsia y que su actividad no difiere significativamente de la observada en placentas de mujeres sanas. Sin embargo, luego de la estimulación con la citoquina inflamatoria FNT-alpha;, los citotrofoblastos de placentas de mujeres con preeclampsia mostraron incremento de mayor magnitud en la actividad procoagulante del FT. Este hecho sugiere que los citotrofoblastos de placentas de pacientes preeclámpsicas son particularmente sensibles a la estimulación inflamatoria. Es sabido que durante la gestación normal se produce también aumento de la respuesta inflamatoria en la madre. Ello es puesto de manifiesto a través de signos de activación de los leucocitos, con incremento de la expresión de CD 11b, CD 14 y CD 64,⁸ así como de los monocitos, con mayor expresión de CD 11a, CD 11c, CD 18, CD 68 y del ARNm de la proteína 1 quimiotáctica de los monocitos.^9,23 Los hallazgos presentados, que demuestran la relación entre una citoquina inflamatoria y el aumento de la actividad procoagulante, indican que una alteración inicial de la respuesta inflamatoria puede desencadenar los eventos fisiopatológicos subsiguientes que resultan en la preeclampsia.

Se conoce que el FNT-α induce apoptosis en una variedad de células.²⁴ Los resultados de este trabajo indican que ello también se verifica en el caso de los citotrofoblastos. Nuestros hallazgos concuerdan, en parte, con los de Crocker y col.,²⁵ quienes revelaron que los citotrofoblastos y los sincitiotrofoblastos sufren apoptosis luego de la estimulación con la combinación de FNT-α e interferón gamma (INF-γ). Dichos autores también demostraron que el grado de apoptosis era mayor en los citotrofoblastos de mujeres con preeclampsia después de la estimulación con la citoquina. A diferencia de esos resultados, no hallamos que el índice de apoptosis difiriera en células placentarias de pacientes con preeclampsia, comparadas con el observado en placentas de mujeres sanas. Una posible explicación de esta diferencia podría relacionarse con que, en nuestro estudio, la apoptosis fue inducida por FNT-α solo y no por la combinación de éste con INF-γ usada por Crocker y col.²⁵

El mecanismo exacto por el cual el FNT-α, una citoquina inflamatoria, induce la actividad procoagulante es aún incierto. Las células apoptóticas poseen propiedades trombogénicas y expresan incremento de la actividad del FT, pero no del antígeno de ese factor.²⁶ Ello se atribuye a la activación del FT presente en la membrana celular, cuando la fosfatidilserina es expuesta al tener lugar la apoptosis. Propusimos que el aumento de la actividad del FT podía relacionarse con el incremento de la apoptosis de los citotrofoblastos, en condiciones de preeclampsia. Sin embargo, dicho grado de apoptosis no fue mayor en las células de mujeres con preeclampsia, lo cual torna poco probable que la respuesta apoptótica a la inflamación sea el mecanismo final responsable del aumento del potencial procoagulante.

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