PORTACIÓN DE <I>ESCHERICHIA COLI</I> EN CONVIVIENTES DE CASOS DE SÍNDROME URÉMICO HEMOLÍTICO

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Introducción

Los registros oficiales de la Argentina muestran que el síndrome urémico hemolítico (SUH) es endémico y presenta una de las mayores incidencias en el mundo, con una estadística de aproximadamente 10 casos/100 000 niños menores de 5 años, y 300 a 400 casos anuales en la última década.¹ Estos valores son cinco veces mayores que los notificados en el resto del mundo, incluso en países con características geográficas y sociales similares, como Chile y Uruguay.¹

La enfermedad constituye la primera causa de insuficiencia renal aguda en la edad pediátrica y la segunda de insuficiencia renal crónica; también puede afectar otros tejidos parenquimatosos como intestino, páncreas, corazón y sistema nervioso central. Además, es responsable del 20% de los trasplantes renales en niños y adolescentes.^2-4

Se ha identificado Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC [Shiga toxin-producing Escherichia coli]) como agente causal de la forma posentérica de SUH.⁵ Escherichia coli O157:H7 es el serotipo prevalente asociado con grandes brotes y casos esporádicos de colitis hemorrágica y SUH.⁶ Sin embargo, existen más de 100 serotipos que tienen un potencial patogénico similar.

La enfermedad no tiene tratamiento específico y el paciente sólo recibe terapia de sostén; hasta el presente no se ha demostrado que la utilización de una terapia antimicrobiana aporte algún beneficio. Por otra parte, algunos autores han postulado que dicho tratamiento puede aumentar la gravedad del cuadro y precipitar la evolución a SUH,⁷ posiblemente debido a una mayor liberación y absorción de las citotoxinas.⁸ Las quinolonas, trimetoprima y flurazolidona son potentes inductores de expresión del gen de la toxina Shiga 2 (stx₂) e incrementan el nivel de toxina en el intestino.⁹ Por lo tanto, hasta que no se lleve a cabo un estudio multicéntrico, aleatorizado, que demuestre la eficacia del tratamiento, se aconseja no suministrar antibióticos durante el período prodrómico o de estado.

Numerosos estudios realizados en diferentes países, incluida la Argentina, permitieron confirmar el papel del ganado vacuno como principal reservorio de STEC, aunque las ovejas y las cabras también son descritos como reservorios importantes.^10,11

Escherichia coli productor de toxina Shiga se transmite al hombre a través de los alimentos y el agua contaminados con la materia fecal de animales portadores. Otras rutas de transmisión propuestas se asocian con el contacto directo con personas o con animales portadores a través de la vía fecal-oral,¹² o la contaminación cruzada durante la preparación de alimentos.

Distintos hallazgos epidemiológicos sostienen que en la Argentina la ruta de transmisión persona a persona desempeña un papel central en el comportamiento endémico de la enfermedad. Una dosis infectiva muy baja (100 a 500 organismos) es suficiente para producir enfermedad, y la existencia de un número alto de menores y adultos portadores asintomáticos sirve de base a esta hipótesis.^13,14
Se debe enfatizar también que los individuos que están recuperándose de un episodio diarreico pueden constituir un riesgo de transmisión por la excreción de STEC intermitente y prolongada, por lo cual se deben extremar las medidas de control.¹⁵ Es por ello que resulta fundamental el estudio de los contactos, sintomáticos y asintomáticos, convivientes de casos de SUH, para vigilar la circulación y diseminación de STEC en la comunidad, así como para correlacionar y establecer el diagnóstico etiológico en aquellos casos de SUH en los cuales todos los criterios diagnósticos son negativos.
Los objetivos de este trabajo fueron demostrar la infección por STEC y establecer la condición de portador de este agente patógeno en contactos convivientes de casos de SUH.

Materiales y métodos

Durante el período comprendido entre enero de 1996 y diciembre de 2011, y como parte de la vigilancia epidemiológica de los casos de SUH, se estudiaron 238 muestras de materia fecal y 30 muestras de suero de 257 contactos convivientes de pacientes internados en el Hospital Interzonal Especializado Materno Infantil de la ciudad de Mar del Plata, y en otros centros de salud, tanto públicos como privados, de la ciudad y de localidades cercanas. De los contactos se recolectó materia fecal y primera muestra de suero. Simultáneamente, se completaron las fichas epidemiológicas correspondientes. En los casos y en los contactos con aislamiento positivo se realizó el estudio de persistencia de excreción de este microorganismo.

Se utilizaron tres criterios diagnósticos para establecer la infección por STEC: 1) aislamiento y caracterización del patógeno; 2) detección de Stx libre en materia fecal (StxMF); 3) detección de anticuerpos anti-Stx en suero.¹⁶ Para establecer la condición de portador sólo se utilizó el primer criterio diagnóstico.

Para la identificación de STEC se sembraron placas de agar MacConkey con sorbitol (Difco Laboratorios, Detroit, EE.UU.) que fueron incubadas a 37°C durante 18 horas.¹⁷ Se utilizó la técnica de reacción en cadena de la polimerasa múltiple de la zona de crecimiento confluente y de las colonias presuntivas, para detección de los genes stx₁, stx₂, y rfb_O157.¹⁸ La caracterización genotípica de los marcadores de virulencia accesorios, eae (intimina) y ehxA (enterohemolisina), se efectuó por PCR, según lo descrito por Ganon y colaboradores, y Schmidt y col., respectivamente.^19,20

Los aislamientos de STEC fueron identificados por pruebas bioquímicas²¹ y serotipificados utilizando los antisueros de E. coli monovalentes somáticos O26, O91, O111, O145, O157 y flagelar H7, provistos por el Instituto de Producción de Biológicos-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán. Se realizaron pruebas para descartar falsos positivos por reacciones cruzadas con el antisuero O157 y se estudiaron los biotipos del serotipo O157:H7 con pruebas de fermentación de dulcitol, sorbitol, rafinosa, ramnosa y actividad de beta-glucuronidasa.

El perfil de sensibilidad de las cepas aisladas se realizó según el método de difusión por discos de Kirby y Bauer, de acuerdo con las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards Institute.²²

Posteriormente, las colonias de E. coli aisladas fueron procesadas por métodos de subtipificación molecular mediante la técnica de macrorrestricción con la enzima XbaI y separación por electroforesis de campos pulsados (XbaI-PFGE), según el protocolo estandarizado por los Centers for Diseases Control and Prevention, de los Estados Unidos, con algunas modificaciones.²³

Las muestras de materia fecal y suero fueron enviadas al Servicio de Fisiopatogenia del INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán para la detección de StxMF mediante la técnica de neutralización del efecto citotóxico en células Vero con anticuerpos monoclonales para Stx₁ y Stx₂. La determinación de anticuerpos anti-Stx se realizó por ensayos de neutralización del efecto citotóxico en células Vero.²⁴

Se correlacionaron los datos de los aislamientos STEC positivos de los contactos con los datos del caso de SUH correspondiente.

Se realizó el análisis descriptivo de las variables en estudio y el cálculo de las medidas de tendencia central mediante el uso del paquete Epi Info™ 3.5.4.

El presente trabajo se llevó a cabo teniendo en cuenta los aspectos éticos principales para la protección de la salud de los seres humanos según lo establece la Declaración de Helsinki (World Medical Association, 1972) y sucesivas enmiendas (Resolución 1480/2011 de la Guía para Investigaciones con Seres Humanos y la Ley 11044 de Investigación en Salud). Se mantuvo la confidencialidad de la información obtenida, de acuerdo con la Declaración Internacional sobre los Datos Genéticos Humanos (UNESCO, 2003) y se encriptó toda información sensible, según la Ley 25326 sobre Protección de Datos Personales (textos actualizados y revisados al 9 de enero de 2008).

Resultados
Análisis de casos y contactos estudiados

Entre enero de 1996 y diciembre de 2011 se estudiaron 219 casos de SUH. En 75 de ellos se realizó el relevamiento epidemiológico, que comprendió un total de 257 contactos convivientes, con una mediana de 3.0 contactos/caso, un promedio de 3.4 contactos/caso, una desviación estándar de 2.9 y un intervalo de 1 a 19 contactos/caso. En 12/75 (16.0%) casos fue posible detectar portadores asintomáticos de STEC en el grupo familiar.
Las edades de los contactos convivientes estudiados estuvieron comprendidas entre 6 meses y 82 años, con una mediana de 27 años. El 52.1% era de sexo femenino. El 49.2% era originario de la ciudad de Mar del Plata, mientras que los restantes lo eran de localidades vecinas o bien residían transitoriamente en la ciudad en carácter de turistas.

En 26/257 (10.1%) contactos convivientes asintomáticos se detectó evidencia de infección por STEC por alguno de los tres criterios utilizados.

Evidencias de infección por STEC según los tres criterios microbiológicos

En 9/206 (4.4%) contactos estudiados se detectó Stx2MF. De estos nueve contactos StxMF-positivos, en tres (33.3%) se aisló E. coli O157:H7 productor de Stx₂, mientras que en los seis (66.7%) restantes las muestras resultaron STEC-negativas.

La presencia de anticuerpos anti-Stx fue del 23.3% (7/30) para a-Stx₂ y 3.3% (1/30) para a-Stx₁/Stx₂ en las muestras de suero estudiadas. En ninguno de estos contactos se detectó StxMF. De un contacto que presentó anticuerpos a-Stx₂ se aisló E. coli O157:H7 productor de Stx₂.

Los resultados correspondientes a los contactos con criterio de aislamiento STEC-positivo (13/238; 5.5%) se muestran en la Tabla 1.

El genotipo stx^2a (84.6%), solo o asociado, fue predominante en los aislamientos STEC en relación con stx_1a (15.4%). El 83.3% de las cepas O157:H7 presentaron el perfil genotípico stx_2a/stx_2c, eae, ehxA, y las restantes stx_2a, eae, ehxA. Los serotipos de STEC detectados se detallan en la Tabla 2.

El 66.7% de las cepas O157:H7 perteneció al biotipo C y el 33.3% al biotipo B.

Sólo el 38.0% de los aislamientos presentó resistencia individual o en bloque a ampicilina, amoxicilina clavulánico, ácido nalidíxico, cefalotina, tetraciclina y trimetoprima sulfametoxazol.

Además, se aisló una cepa de E. coli O157:HNM que portó sólo el gen rfb_O157 y ninguno de los genes que codifican para stx₁, stx₂, eae y ehxA.

Tabla 1

Epidemiología molecular

En 3/12 de los casos investigados se detectaron contactos asintomáticos que portaban la misma cepa que el caso índice. Cepas idénticas de STEC O145:NM (stx_2a, eae, ehxA, del patrón ARENMX01.0061), O157:H7 (stx_2a /stx_2c, eae, ehxA, del patrón AREXHX01.0447), y O121:H19 (stx_2a, eae, ehxA, del patrón AREXKX01.0011), asociados con los casos #1, #3 y #4, respectivamente, fueron aislados en sus contactos correspondientes (véase Tabla 1).
En 1/12 casos se detectaron cepas STEC distintas en el caso y el contacto asintomático. Del caso #2 se aisló STEC O157:H7 stx_1a/stx_2a/stx_2c, eae, ehxA, del patrón AREXHX01.0139, y de una hermana de 14 años se identificó STEC ONT:H19 stx_2vhb, ehxA, saa, del patrón AREVCX01.0026.

En 8/12 casos de SUH no se pudo identificar el agente etiológico, mientras que al realizar la investigación en los contactos familiares se pudo detectar que portaban cepas STEC. En 4/8 casos, las cepas correspondieron a O157:H7 stx_2a/stx_2c, eae, ehxA, y en los casos restantes, a STEC O145:NM stx_2a, eae, ehxA (1); O174:HNT stx₂ (1), y ONT:HNM stx₁, ehxA (2).

En la Figura 1 se muestran los patrones de XbaI-PFGE de los casos #1 a #4 y de sus respectivos contactos, y de los contactos correspondientes a los casos #5 a #9.

Figura 1

Seguimiento de la excreción

En 4/13 (30.8%) contactos se realizó el estudio de persistencia de excreción. Sólo en el contacto asintomático del caso #3, abuela de 55 años, se demostró excreción prolongada, con 20 días de duración a partir del primer coprocultivo.

En los contactos del caso #7 (hermano de 5 años), del caso #9 (madre de 36 años) y del caso #10 (padre de 32 años) no se detectó excreción prolongada, ya que no se aisló STEC en el coprocultivo correspondiente al primer control realizado a los 7-10 días.

Conclusión

En el período comprendido entre enero de 1996 y diciembre de 2011, en 16% (12/75) de los casos de SUH estudiados con relevamiento epidemiológico se detectaron portadores asintomáticos de STEC, lo cual pone de manifiesto: 1) el patógeno circula tanto en el grupo familiar como institucional, afectando en forma asintomática a niños y adultos, sin diferencias por sexo; 2) la transmisión persona a persona indicaría condiciones de higiene inadecuadas en dichos ámbitos; 3) el estudio de los contactos familiares e institucionales, como potencial fuente de diseminación de STEC, es importante para adoptar las medidas necesarias, de manera tal de disminuir la transmisión y la aparición de nuevos casos. En esta investigación, debido a dificultades logísticas, sólo se realizó el estudio epidemiológico de 75/219 (34%) casos de SUH, con lo cual se hace necesario reforzar la concientización de la importancia del estudio epidemiológico y de la sistematización de su implementación.

En el presente trabajo, algunas de las cepas detectadas en los portadores sanos correspondieron a los serotipos O157:H7, O145:NM, O121:H19 y a los tipos/variantes de Stx prevalentes (stx_2a; stx_2a/stx_2c), de alta virulencia, detectados en muestras de pacientes con SUH notificados a nivel nacional.²⁵ Fenotípicamente, las cepas de E. coli O157:H7 del biotipo C (fermentador de dulcitol, rafinosa y ramnosa) resultaron prevalentes, al igual de lo observado principalmente en la Argentina.²⁵ También se detectaron cepas del biotipo B, cuya circulación no se registraba en Mar del Plata.

A los contactos que resultaron portadores de STEC no se les prescribió terapia antibiótica.

Mediante herramientas de epidemiología molecular se pudo comprobar en tres casos (#1, #3 y #4) que las cepas STEC presentaban los mismos patrones de XbaI-PFGE que sus contactos familiares, lo que estaría indicando que se trataba de brotes familiares difusos.^26,27 La denominación de brote familiar se debe a que una única cepa se estaría diseminando en dicho grupo, y difuso, a que al tratarse de infecciones asintomáticas es difícil la visualización de los portadores, lo que impide la identificación del brote. En un caso (#2) se observó que el serotipo de STEC no fue coincidente con el serotipo detectado en el contacto asintomático correspondiente, lo que indica que distintas cepas STEC estarían circulando en el ámbito familiar.

En aquellos casos de SUH (n = 8; Tabla 1) en los cuales los criterios diagnósticos fueron negativos, pero en sus contactos se aisló STEC, se puede plantear la hipótesis que el agente etiológico causante del SUH podría coincidir con el aislamiento del contacto. En la Argentina existe un antecedente de un brote familiar de infección por STEC O145:NM en el que tres convivientes familiares portaban el patógeno, el cual no pudo ser detectado en el caso índice de SUH.²⁸ Esto se podría explicar debido a la dificultad de detección del patógeno una vez instalado el cuadro clínico de SUH, donde el microorganismo suele encontrarse en bajo número.

Con respecto a la relación entre manipulación o elaboración de carnes o derivados como factor de riesgo para la infección por STEC entre los contactos, uno de ellos refirió que se dedicaba a la manufactura de pollos frescos (preparación de milanesas de pollo) y otro contacto mencionó haber trabajado en una carnicería cuatro meses antes de la toma de muestra para el aislamiento en el contexto del estudio. En ambos portadores se aisló STEC O157:H7. Esto demuestra la importancia de la pronta identificación de contactos sanos para cortar la cadena de transmisión, ya que STEC podría estar circulando en portadores asintomáticos que trabajan en la industria de los alimentos, con el riesgo de introducir esta bacteria en la cadena alimentaria por períodos desconocidos.

Resulta fundamental que los contactos que conviven con un caso reciente de SUH o de infección por STEC extremen las medidas de higiene personal y en la preparación de alimentos para prevenir la aparición de casos secundarios, sobre todo en aquellos integrantes de la familia que se encuentran en el grupo de edad de riesgo.

Dados los riesgos que presenta este peligroso microorganismo para la salud de la población, y que aún no existe inmunización o tratamiento que impida la aparición de la patogénesis del SUH, se considera muy importante continuar alertando en forma sostenida a la comunidad por medio de actividades de educación para la salud sobre sus vías y vehículos de transmisión y trabajar sobre las estrategias de prevención, fundamentalmente en los controles a lo largo de la cadena de producción de los alimentos, de manera de lograr una disminución de las infecciones por STEC.

Agradecimientos: A la doctora Diana Gómez, médica veterinaria y bacterióloga clínica e industrial, por su colaboración en este trabajo.

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