La diabetes tipo 1 (DBT1) es un trastorno de la homeostasis de la glucosa ocasionado por la inflamación crónica autoinmune de los islotes de Langerhans con pérdida de las células que producen insulina. La periinsulitis e insulitis tornan a la célula beta incapaz de producir insulina suficiente, por la acción de citoquinas.
En el diagnóstico, algunos pacientes aún presentan masa de células beta residual, que por un tiempo responden a la glucosa, lo que ha motivado la búsqueda de agentes para preservar esta masa funcional, interfiriendo con la autoinmunidad en curso. Los fármacos inmunosupresores sistémicos tuvieron éxito inicialmente; sin embargo, con su suspensión la autoinmunidad recurrió, lo que indica que estos agentes deberían ser utilizados a largo plazo, con los efectos adversos que ello implica. Los anticuerpos anti-CD3 permitieron revertir clínicamente la hiperglucemia, aunque persisten cuestionamientos acerca de la inmunodepleción transitoria y los efectos adversos asociados relacionados con citoquinas. Por lo tanto, se necesita un agente supresor de DBT que no genere inmunosupresión sistémica no específica.
En la DBT1 las células presentadoras de antígeno se alojarían en los islotes, en respuesta a una anomalía microambiental aún no identificada. Esto provoca que estas células y las células dendríticas adquieran antígenos residentes en las células beta derivados de las células beta necróticas y/o apoptóticas. Las células dendríticas migratorias entran en un programa de maduración que las hace capaces de activar las células T mientras se acumulan en los ganglios linfáticos pancreáticos de drenaje.
Las células dendríticas son capaces de activar y mantener redes celulares “supresoras” que aparentemente son reguladoras en un estado de “inmadurez” funcional. Es posible conferir inmadurez funcional a las células dendríticas disminuyendo las vías de coestimulación: se ha confirmado que la administración de estas células puede facilitar la supervivencia de los injertos y prevenir la enfermedad autoinmune y su recurrencia. Los autores han mostrado que la administración de células dendríticas de ratones NOD con bajo nivel de expresión de CD40, CD80 y CD86 (inducidas por oligonucleótidos antisentido dirigidos a los extremos 5’ de los respectivos transcriptos primarios) en receptores singénicos puede retrasar y prevenir la aparición de DBT. Los transportadores de micropartículas pueden dirigir a las células dendríticas al sitio de administración y, una vez fagocitadas, los contenidos pueden delinear el fenotipo funcional de la célula dendrítica. Las microesferas biodegradables de ácido poli-(láctico-co-glicólico) (APLG) inducen la maduración de las células dendríticas aumentando las moléculas coestimulatorias CD40, CD80, y CD86. Los autores eligieron incorporar oligonucleótidos antisentido contra CD40, CD80 y CD86 en el sistema de distribución de microesferas PROMAXX (Baxter Healthcare), que ha mostrado ser seguro y efectivo en ensayos clínicos en humanos. In vivo, esta tecnología es neutra con respecto al estado de maduración de las células dendríticas en comparación con las propiedades inmunoestimuladoras de las fórmulas basadas en APLG. Esto es crítico para la inmunosupresión en la que las células dendríticas actúan como mediadores. Los autores presentan una vacuna basada en microesferas PROMAXX en la cual los nucleótidos antisentido han mostrado ser capaces de transformar las células dendríticas en supresoras de DBT y de prevenir y aún revertir la DBT autoinmune de reciente inicio.
Diseño y métodos
Se sintetizó la fórmula de microesferas con oligonucleótidos antisentido PROMAXX, dirigidos a CD40, CD80 y CD86 (AS-MSP). Se utilizaron ratones hembra NOD/LtJ, NOD-scid, C57BL/6, y Balb/c de 5 a 22 semanas. Las microesferas preparadas con AS-MSP, o con secuencias control mezcladas de oligonucleótidos (SCR-MSP) se distribuyeron en fórmulas de solución buffer de fosfato salino (PBS) estéril. Las preparaciones de AS-MSP, SCR-MSP o PBS fueron administradas por vía subcutánea proximal a los ganglios linfáticos pancreáticos en animales NOD de 5 a 8 semanas, en el estudio de prevención inicial. Para determinar su eficacia en la DBT1 de reciente comienzo, primero trataron los ratones diabéticos con insulina hasta la estabilización de la glucemia. Se suspendió el tratamiento y se inyectaron las microesferas de la misma forma.
Para determinar si la preparación indujo poblaciones de células inmunológicas reguladoras, los autores aislaron bazos de animales sin DBT, les administraron AS-MSP, y prepararon células aisladas. Al mismo tiempo se introdujeron preparados de células aisladas en células T. Los esplenocitos y las células T enriquecidas se transfectaron a ratones NOD-scid de 7 a 10 semanas por inyección intravenosa y se monitorizó la DBT.
Se realizaron análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) en el bazo o ganglios linfáticos de ratones tratados con éxito, en forma periódica, sin DBT o con reversión de la DBT de reciente comienzo, determinándose el fenotipo de superficie de las células T. Las células se incubaron con anticuerpos específicos usados como control para uniones no específicas en la superficie celular.
Se aislaron bazos de ratones seleccionados en forma aleatoria y se enriquecieron con células T. Se cocultivaron con esplenocitos irradiados de ratones alogénicos o singénicos en presencia/ausencia de ovoalbúmina para medir la proliferación de células T de los ratones NOD tratados con AS-MSP hacia aloantígenos o antígenos nominales. Se evaluó la proliferación en respuesta a lisados de derivados de la línea celular NIT-1. Se determinó el grado de insulitis del páncreas.
Se calculó la fluorescencia a través de imágenes y luego los ratones recibieron microesferas fluorescentes (FluoSpheres), PBS (control) o una mezcla de FluoSpheres y AS-MSP. En un estudio posterior se inyectó una fórmula PROMAXX de una secuencia de ARNsi no dirigida de oligonucleótidos marcados con Cy3.
Se determinaron los niveles de moléculas coestimuladoras en células dendríticas cargadas con AS-MSP en el bazo in vivo: se trataron los esplenocitos de los ratones tratados con FluoSpheres y PBS, o con FluoSpheres y AS-MSP, con aloficocianina (APC) y CD40 ficoeritrina (PE), CD80 PE o CD86 PE anti CD11c de ratón.
Resultados
Las AS-MSP mostraron un tamaño promedio de las partículas de 2.5 µm. El contenido de oligonucleótidos en las microesferas fue 70% del peso.
Luego de un aumento inicial de la liberación de oligonucleótidos, el porcentaje acumulado de liberación fue proporcional a la raíz cuadrada del tiempo. La mayor parte de la liberación del fármaco ocurre luego de que la microesfera ha sido captada por las células in vivo.
La administración de una inyección de AS-MSP en ratones hembras NOD prediabéticas dirigida al extremo 5’ de los transcriptos de CD40, CD80 y CD86, entre las 5 y 8 semanas, retrasó el inicio de la DBT, y 8 inyecciones consecutivas fueron eficaces en prevenir la enfermedad. Los ratones tratados con preparados de control y los no tratados presentaron DBT a las 22 semanas.
Las ratas NOD entre las 12 y 16 semanas tuvieron DBT y fueron tratadas con insulina hasta la estabilización de la glucemia que se observó a los 10 a 18 días de tratamiento. La insulina fue suspendida y se inyectó AS-MSP, SCR-MSP, o PBS. La administración de AS-MSP fue efectiva en revertir la hiperglucemia, manteniéndose la glucemia estable aun luego de la suspensión del tratamiento con microesferas.
En tanto que los ratones tratados con SCR-MSP y los controles con DBT mostraban insulitis significativa y una masa de islote indistinguible, respectivamente, los autores observaron una arquitectura normal de los islotes con ausencia de insulitis en los receptores de AS-MSP.
En informes previos los autores sugieren que las células dendríticas tratadas con antisentido ex vivo fueron supresoras al menos en parte, aumentando la prevalencia de las células T posiblemente reguladoras CD4+, CD25+ (células Treg). La AS-MSP sola, y no las microesferas de control o PBS, aumentaron la prevalencia de células T Foxp3⁺ CD25⁺.
La transferencia adoptiva de DBT en receptores NOD-scid fue casi totalmente anulada en presencia de esplenocitos derivados de receptores de AS-MSP libres de DBT.
Las AS-MSP inyectadas in vivo se acumulan en los ganglios linfáticos pancreáticos y el bazo y producen disminución de la expresión de las moléculas de superficie coestimuladoras en células esplénicas dendríticas in vivo. Para determinar la ruta de migración de AS-MSP, los autores utilizaron tecnología de imágenes para observar la acumulación temporal de una mezcla 1:1 de FluoSpheres y AS-MSP. Tres horas luego de la inyección intraperitoneal, las esferas fluorescentes se acumularon en sitios relacionados con el páncreas y el bazo. La intensidad de la fluorescencia no se modificó durante 72 horas. Se confirmó esta localización con la escisión del páncreas y bazo de las ratas monitorizadas vivas en distintos focos en páncreas que se interpretaron como ganglios linfáticos y en distintos focos del bazo. Aunque la fluorescencia se vio independientemente de si la mezcla contenía AS-MSP o no, su intensidad fue diferente en los 2 órganos en los distintos tiempos.
Esta acumulación se confirmó de igual manera, con la inyección de ARNsi para CD86 marcado con Cy3 de PROMAXX a las 3 horas de la inyección, pero sólo cuando la inyección subcutánea se realizó proximal a los ganglios linfáticos pancreáticos.
Para confirmar que la administración de AS-MSP produjo una disminución de CD40, CD80 y CD86 en células dendríticas in vivo, se inyectó a los ratones con una mezcla de FluoSpheres con PBS como control o con AS-MSP. Se midieron sus niveles en células CD11c⁺, que concentran la mezcla un día después de la inyección con mantenimiento de estos niveles en comparación con células CD11⁺de los controles en un período de 6 días. La excepción fue el día 3 para CD40.
La naturaleza del autoantígeno inicial permanece desconocida. Se considera que reside en la célula beta, por lo que se usaron lisados celulares de NIT-1 como fuente de antígeno de células beta en cocultivos de células T de ratas NOD libres de DBT tratadas con AS-MSP para determinar la posibilidad de hiporrespuesta específica de antígeno. Se observó una disminución de la producción de factor de necrosis tumoral alfa por las células T de los tratados con AS-MSP, libres de DBT, aun en presencia del lisado de NIT-1, con hipoproliferación de células T. La producción de interferón gamma también disminuyó levemente, en forma no significativa, en comparación con los controles tratados con PBS.
Discusión
Los autores muestran la utilidad de las microesferas de ácido nucleico PROMAXX para la producción de una vacuna supresora de DBT, por su versatilidad, que permite transportar los agentes activos en micropartículas in vivo, para la modulación del sistema inmunitario.
La capacidad de AS-MSP de revertir la hiperglucemia de reciente comienzo es fundamental, se debería a la preservación de la masa residual de células beta. Por el momento no se ha diferenciado este hecho de una regeneración potencial de las células beta. La evidencia sugiere la capacidad de funcionamiento residual de la masa de células beta al diagnóstico de DBT. Estos datos son los primeros en mostrar un sistema bien definido de micropartículas que puede revertir la hiperglucemia. Además los autores han confirmado que el número de células T CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺ aumenta en ratones hembra NOD que reciben AS-MSP. Estos hallazgos podrían explicar la capacidad de las células T de ratones tratados con AS-MSP libres de DBT para prevenir la cotransferencia de la enfermedad a receptores NOD-scid. Estas células mostraron escasa proliferación en el lisado de NIT-1 in vitro mientras que hubo proliferación importante en cocultivos con esplenocitos alogénicos irradiados o con ovoalbúmina.
En muchos estudios se concluyó que las fórmulas de microesferas inyectadas son rápidamente tomadas por las células presentadoras de antígenos locales o migratorias, especialmente las células dendríticas, y se acumulan en órganos linfáticos proximales al sitio de inyección. El mecanismo por el cual el antígeno y la especificidad de las células/tejidos son adquiridos por las células dendríticas llenas de microesferas sería un proceso en el cual las células dendríticas migratorias adquieren potencialmente las microesferas que se inyectan proximales físicamente a un sitio de inflamación continua y son guiadas por señales proinflamatorias derivadas del páncreas diabético y adquieren los antígenos de células beta pancreáticos en forma de células apoptóticas en el sitio de inflamación. Estas células dendríticas saldrían del tejido inflamado y se acumularían en los ganglios linfáticos donde pueden ocuparse no sólo con células T efectoras sino también células Treg. Se ha demostrado que las células dendríticas que adquieren las células apoptóticas ingresan en un estado funcional de inmadurez, que podría resultar en tolerancia a antígenos adquiridos. Los autores sostienen que un proceso similar ocurre inmediatamente después de la administración de AS-MSP en ratones NOD. La inflamación en el páncreas guiaría a las células dendríticas cargadas con AS-MSP a adquirir el antígeno de células beta, y su acumulación en los ganglios linfáticos del páncreas facilitaría su interacción con las células Treg, que inducirían hiporrespuesta específica de células beta o tolerancia funcional a los antígenos de células beta. Los autores mostraron que las microesferas en las células dendríticas en el bazo disminuyen los niveles de CD40, CD80, y CD86 en la superficie y en ganglios linfáticos.
Es muy importante la acumulación de microesferas en el páncreas si se administran en una zona cercana a los ganglios linfáticos pancreáticos, lo que no ocurre si se administra en una zona que no drena en estos ganglios, ya que sugiere que estos últimos deben estar involucrados en las intervenciones inmunorreguladoras. El objetivo de los autores en estudios futuros es identificar el mecanismo preciso de los cambios de las células dendríticas en respuesta a AS-MSP.
Los investigadores postulan que AS-MSP estabiliza subgrupos de células dendríticas en estado de disminución de CD40, CD80 y CD86 hacia la supresión de la DBT. Los autores investigan el posible mecanismo experimental. La administración de insulina por sí sola no sería la responsable del efecto de AS-MSP. Estos hallazgos deben ser trasladados rápidamente a la clínica para preservar la masa residual de células beta en la DBT autoinmune reciente o preclínica en seres humanos.