DETECCIÓN DE BACTERIAS INTRACELULARES EN AMEBAS DE VIDA LIBRE EN BOGOTÁ, COLOMBIA

Sonia Marcela Rosas Arango¹,Liliana Caycedo Lozano²,Margie Lorena Segura Alba³ y Nataly Gil⁴

¹Bioquímica, Docente, Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca, Bogotá, Colombia
²Química, Docente, Universidad colegio Mayor de Cundinamarca, Bogotá, Colombia
³Bioquímica, Hospital Bosa II Nivel E.S.E, Bogotá, Colombia
⁴Bioquímica, Hospital de La Ceja, Antioquía, Colombia

Bogotá, Colombia (SIIC)

Se aislaron amebas de vida libre de ambientes de humedal y se comprobó la presencia de bacterias intracelulares que pueden estar asociadas con procesos infecciosos en pacientes inmunocompetentes e inmunocomprometidos. Esto genera una perspectiva relevante para la salud pública y el control de enfermedades emergentes y reemergentes en hábitats urbanos y semirrurales.

Las amebas de vida libre (AVL) son un grupo de microorganismos ubicuos presentes en ambientes como agua, suelo y materia orgánica en descomposición. Son capaces de causar enfermedades de importancia clínica como la meningoencefalitis amebiana primaria (MEAP), causada por el género Naegleria, y queratitis por Acanthamoeba (QA), encefalitis granulomatosa amebiana (EGA) y acanthamoebosis cutánea (AC), especialmente en la población con compromiso inmunológico.

Para la salud pública resulta de suma importancia la identificación de los géneros de las AVL que habitan en humedales y zonas inundables en Bogotá y en la región de Cundinamarca. Así, el aislamiento a partir de muestras aleatorias de zonas urbanas o rurales permite determinar y caracterizar bacterias intracelulares, lo cual puede convertirse en un posible indicador que relaciona la incidencia de enfermedades emergentes y reemergentes en pacientes inmunocompetentes e inmunocomprometidos, a expensas de las bacterias mencionadas anteriormente.
Este estudio permitió identificar, en las muestras analizadas, AVL de los géneros Acanthamoeba, Hartmanella y Naegleria; posteriormente se realizó la lisis amebiana y se aislaron bacterias que están en asociación con las amebas. Se halló Enterobacter cloacae, Klebsiella oxytoca, Escherichia coli, Bacillus licheniformis y Bacillus cereus; estas bacterias se encuentran principalmente en el medioambiente, pero pueden estar implicadas en ciertos procesos patológicos.

Dentro del estudio descriptivo transversal se estableció el protocolo para el cultivo de las AVL, seguido de la lisis amebiana y la identificación bacteriana.

Se tomaron en total 20 muestras de agua en siete sitios dentro y fuera de Bogotá; en cada localización se llevó a cabo la medición de temperatura y pH, y, de manera cualitativa, la turbidez en escala baja, mediana y alta. Se eligieron medios de cultivo óptimos para el crecimiento y viabilidad de las AVL, medios con base en solución salina de Page (agar no nutritivo), Hartmannella 1 y Hartmannella 2.

Al agar no nutritivo se le adicionaron de dos a cuatro unidades formadoras de colonias (UFC) de una cepa ATCC de Escherichia coli para proveer nutrición a las posibles AVL que se encontrasen en la muestra sembrada. Se realizó montaje en fresco para observar las características microscópicas que presentaron los medios.

Después de una observación en fresco durante 10 días de las muestras, se aislaron de los agares los trofozoítos de AVL, se lavaron con solución salina y se centrifugaron durante 15 min para su purificación y sedimentación; el sedimento se centrifugó por 30 min; después de ese tiempo se montaron en fresco y se verificaron cambios morfológicos; se repitió el proceso de centrifugación a 3000 rpm; finalmente, se realizó un montaje en fresco en el que se hallaron algunas bacterias. El producto de esta lisis amebiana se sembró en agar sangre, agar chocolate y agar MacConkey a 37°C durante 24 horas; también se realizaron coloraciones de Gram y Ziehl-Neelsen.

Se analizó el crecimiento en cada uno de los agares sembrados y por medio de la coloración de Gram se determinó la afinidad por coloración; posteriormente se identificó el género y la especie de las bacterias producto de la lisis amebiana.

In situ se determinaron las propiedades fisicoquímicas, el pH promedio fue de 8.0 y la temperatura de 18°C; en relación con la turbidez, fue valorada cualitativamente como media.

De las AVL encontradas, purificadas y a las que se les produjo lisis, se recuperaron aislamientos de Enterobacter cloacae, Klebsiella oxytoca, Escherichia coli, Bacillus licheniformis y Bacillus cereus, lo que puso de manifiesto la capacidad albergar bacterias de manera intracelular.
Existe una asociación ameba-bacteria en la que se pueden relacionar procesos ecológicos dentro del microambiente que se origina en la naturaleza.

Existe una asociación ecológica entre las AVL y las bacterias en el microambiente; una de las principales radica en la biopelícula (biofilm), que consiste en microcolonias bien organizadas envueltas en matrices poliméricas. Dentro de estas biopelículas, las AVL constituyen el principal regulador de la población bacteriana y son organismos de interés en la adaptación de las bacterias al interior de las células eucariotas; esto permite la adaptabilidad de bacterias como Legionella y su resistencia a situaciones adversas, así como la propagación rápida en condiciones favorables.

En este estudio, después de las lisis de las AVL encontradas se logró identificar aislamientos de Enterobacter cloacae, Klebsiella oxytoca, Escherichia coli, Bacillus cereus y Bacillus licheniformis. En los últimos años, las enterobacterias se han asociado con la presencia de resistencia a los antimicrobianos y con la aparición en cuadros clínicos de las llamadas enfermedades infecciosas reemergentes, con repercusiones sociales y económicas. Además, las bacterias gramnegativas aisladas, al disponer de un sistema de cápsula mucoide alrededor de la bacteria que impide la fagocitosis, favorecen su frecuencia de presentación en aislamientos de AVL, e incluso pueden coexistir con las AVL en la reproducción in vitro en el agar no nutritivo.

En relación con la presencia de Enterobacter cloacae, este microorganismo es conocido como agente causal de meningitis neonatal y sepsis, origina infecciones del tracto urinario, sobreinfección en heridas y neumonías. El aislamiento se obtuvo de las zonas 3, 5 y 6, asociado con las AVL Hartmanella spp. y Acanthamoeba spp.

Klebsiella oxytoca se ubica dentro del grupo de coliformes que causan infecciones adquiridas principalmente en los hospitales, en su mayoría en pacientes con compromiso inmunológico o en aquellos que requieren cuidados intensivos; se han registrado brotes de fuentes ambientales que involucran con frecuencia a K. oxytoca, así como otras enterobacterias que han desarrollado resistencia mediante betalactamasas de espectro extendido (BLEE) y carbapenemasas. Klebsiella oxytoca se encontró en el proceso de lisis de las AVL Hartmanella spp., Acanthamoeba spp. y Naegleria spp. en las zonas 3, 7 y 9.

Respecto del aislamiento de Escherichia coli, esta bacteria se asocia más frecuentemente con sepsis bacteriana, meningitis neonatal, infecciones del tracto urinario y gastroenteritis; la composición de E. coli es compleja y se ha descrito gran número de antígenos O, H y K; al menos el 80% de las cepas de E. coli que causan meningitis tiene el antígeno polisacárido capsular K1. La clasificación serológica de los aislamientos tiene utilidad para fines epidemiológicos, y ciertos serotipos específicos se asocian con virulencia aumentada.
Entre los informes de asociación se ha puesto de manifiesto la relación entre A. castellanii y una cepa de E. coli K1. Se encontró que esta cepa es capaz de sobrevivir intracelularmente, creciendo de forma exponencial y provocando la posterior lisis de la AVL en condiciones favorables de nutrientes en medios de cultivo como el medio Hartmanella; un aspecto interesante es que estos hallazgos muestran notables similitudes de interacción de E. coli K1 con los macrófagos humanos. Estas propiedades de E. coli K1 se han atribuido directamente a la expresión de proteína OmpA, determinante para la unión bacteriana, la invasión, la absorción y la supervivencia dentro de A. castellanii.

En cuanto a los aislamientos de microorganismos grampositivos, se recuperaron del género Bacillus; estos se detectan con frecuencia en aguas de consumo, incluso en las que han sido tratadas y desinfectadas mediante procedimientos aceptables. Esto se debe, sobre todo, a la resistencia de las esporas a los procesos de desinfección.²⁴ Además, el hallazgo sugiere la revisión de los posibles modelos de invasión y adherencia de estas bacterias en las AVL.

Bacillus licheniformis se encuentra comúnmente en el suelo y en las plumas de las aves. Su presencia se detectó luego de la lisis de la ameba Naegleria spp. y se relaciona con la presencia de palomas (Columba livia) en el sitio de muestreo. Entre tanto, Bacillus cereus se asocia con mayor frecuencia con brotes de origen alimentario. Esta bacteria ha sido aislada frecuentemente de hábitats naturales (suelo y plantas), sedimentos, polvo y aguas minerales; el suelo y la rizósfera pueden contener esporas de B. cereus. Los aislamientos se recuperaron de la lisis de las AVL de los géneros Acanthamoeba y Naegleria.

Es importante destacar que, en este trabajo, en las zonas de muestreo se halló una tendencia hacia la alcalinidad del agua, con un pH de entre 7 y 9, lo cual puede asociarse con la supervivencia de microorganismos como bacterias y AVL; la turbidez permitió un acercamiento cualitativo hacia el grado de contaminación por sólidos suspendidos, por lo que es importante considerar el efecto de la filtración de las muestras en el momento del aislamiento para la reproducibilidad de los resultados; estas características fueron tenidas en cuenta a la hora de establecer el diseño de protocolo de los medios de cultivo para garantizar la viabilidad de las AVL.

Si bien en Colombia son muy pocas las investigaciones y los artículos publicados sobre el impacto o las enfermedades que tienen relación con las AVL en los seres humanos y los animales, un estudio realizado por Henao y colaboradores, en la ciudad de Cali, refiere la presencia de Naegleria spp. en fuentes públicas de Santiago de Cali. En el Quindio, en 2009, se comunicó el primer caso de queratitis por Acanthamoeba spp. En Santander, Serrano Calderón describe tres casos de úlcera córnea asociados con AVL. Estos estudios muestran la gran importancia que tienen estas AVL en la salud pública, como microorganismos capaces de albergar bacterias de manera intracelular, relacionadas con enfermedades emergentes y reemergentes y la necesidad de investigarlas en profundidad.

Finalmente, este estudio refleja un dato importante para la salud pública, si se tiene en cuenta que en Bogotá no existe un trabajo que asocie las zonas objetivo del muestreo con la presencia de AVL de los géneros Acanthamoeba, Hartmanella y Naegleria; estas AVL pueden implicar focos de enfermedades si las personas susceptibles tienen contacto directo con estas fuentes de agua, especialmente gente sin techo, niños y ancianos.

En general, en muchos casos no se sospecha de enfermedades ocasionadas por AVL como la queratitis amebiana primaria o la meningoencefalitis; debido a esto, es importante determinar la frecuencia real de infecciones y sensibilizar al cuerpo médico sobre su presencia en el hábitat urbano.

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